Бирсс грунт п: БИРСС Грунт-П | Грунтовки БИРСС

Содержание

БИРСС Грунт-П | Грунтовки БИРСС

Грунтовка для пористых оснований.
ТУ 2316-015-05668056-05 изм. №1,2 «Грунтовки водно-дисперсионные»
Сертификат соответствия № РОСС RU.ХП22.Н00115
Санитарно-эпидемиологическое заключение №77.01.16.231.П.080859.09.08

ОПИСАНИЕ:

Грунт на основе акриловой дисперсии благодаря высокой проникающей способности глубоко пропитывает защищаемую поверхность, укрепляет её, регулирует влагопоглощение, повышает сцепление с основанием. Образует бесцветную плёнку.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ:

«БИРСС Грунт-П» предназначен для грунтования пористых оснований и полов. Препятствует проникновению воды в основание и способствует растеканию наливных составов.

ТРЕБОВАНИЯ К ОСНОВАНИЮ:

Обрабатываемая поверхность должна быть твёрдой, сухой, очищенной от веществ, препятствующих нормальному сцеплению, таких как пыль, грязь, органические загрязнения, отслаивающиеся элементы.

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ:

«БИРСС Грунт-П» наносят кистью, валиком или краскораспылителем. На рыхлые основания с большим поглощением грунтовку наносят в два слоя. Время высыхания не менее 1 часа при температуре 20°С и относительной влажности 60%. Применять при температуре не ниже +5°С.

РАСХОД МАТЕРИАЛА:

Расход 200 — 250 г на 1 м2 (в зависимости от пористости основания).

УПАКОВКА:

Пластиковые ёмкости по 10 кг, 50 кг.

Изготовитель гарантирует соответствие продукта техническим условиям.

Изготовитель не несет ответственности за неправильное использование материала, а также за его применение в целях и условиях, не предусмотренных настоящей инструкцией.

Грунтовка акриловая «БЕТОН-КОНТАКТ»

Бетон-Контакт — сцепляющая фасадная грунтовка с кварцевым наполнителем, акриловый грунт на водной основе.

Грунтовка  Бетон-Контакт — специальный сцепляющий адгезионный грунт с кварцевым наполнителем, для предварительной обработки плотных не впитывающих влагу оснований при отделке фасадов зданий.

Представляет собой водный раствор акрилового латекса, антисептика, смачивателя, кварцевого наполнителя и комплексных добавок.

 Бетон-Контакт предназначен для предварительной обработки плотных, не впитывающих поверхностей (монолитный бетон, зашлифованные монтажные бетонные блоки, кирпич, ацеит и т.п.)

Акриловая грунтовка для бетона БИРСС Грунт БЕТОН-КОНТАКТ

Грунтовка водно-дисперсионная для обработки слабо впитывающих оснований с целью создать шершавый (адгезионный) слой на гладком бетонном основании.Грунт бетон-контакт содержит кварцевый наполнитель в акриловой дисперсии, которая обеспечивает мощное сцепление с поверхностью бетона (2,35 МПа), благодаря чему наполнитель создает на поверхности хорошо развитую шероховатость, которая будет обеспечивать надежный контакт последующего слоя тяжелой штукатурки или плиточного клея и т.п. с основанием стены.

БИРСС Грунт Бетон-контакт 

— акриловая грунтовка для бетона на основе акриловой дисперсии с добавлением калиброванных наполнителей, готовая к применению, не содержит растворителей, взрыво-, пожаробезопасна и нетоксична: образует развитую шероховатую поверхность, повышает сцепление с обрабатываемой поверхностью, не дает сползать штукатуркам и стартовым шпаклевкам, обеспечивает высокий уровень паропроницаемости, стабилизирует поверхность, заполняет микродефекты.

Акриловая грунтовка для бетона БИРСС Грунт Бетон-контакт предназначена для предварительной подготовки плотных, слабо впитывающих влагу оснований (монолитный бетон, железобетон, бетонные стены, панели, блоки и потолки). Рекомендована перед нанесением цементно-песчаных, известково- цементных штукатурных составов, равнителей (стартовых шпаклевок) и облицовочных материалов. 

 

 

 

Грунтовки — Стройматериалы Оптом

Одним из надежных поставщиков строительных материалов оптом в Москве является торговая компания «Строй Опт». Фирма осуществляет доставку крупных партий грунтовок и других строительных материалов по согласованному адресу. Гарантированно, без задержек. Оплата товара возможна любым удобным для клиентов способом, наличными средствами или безналичным переводом.

Грунтовка – специализированный строительный состав для подготовки всевозможных поверхностей перед дальнейшей отделкой. Данный материал улучшает способность сцепления кроющих слоев и выравнивает их впитывающую способность. Кроме того, грунтование выполняет дополнительную функцию антисептика, предотвращая развитие плесени и грибка, защищает от коррозии металлы и улучшает адгезию.

Данный материал имеет различные действующие компоненты в своем составе. Универсальными, для любых поверхностей, кроме черного металла являются смеси на основе акрила. Они быстро высыхают и отличаются нейтральным запахом. Варианты на основе алкидных соединений отлично подходят для деревянных поверхностей. Грунтовки, которые имеют в составе перхлорвинилхлорид, оптимальны для поверхностей из бетона, камня и штукатурки.

В зависимости от основного назначения, данный вид стройматериалов принято разделять на следующие группы: проникающие и «бетоноконтакт». Первые необходимы для заполнения мелких пор в обрабатываемом материале и его укреплении, в целях выравнивания поглощения подложки и уменьшения расхода последующих отделочных материалов. Могут выпускаться в виде водно-дисперсионного раствора, готового к применению и в виде концентрата, предполагаемого разбавление. Вторые в своем составе содержат песок или цемент, необходимые для улучшения сцепливаемости с гладкими поверхностями.

В каталоге сайта компании собраны товары для грунтования от ведущих производителей с мировым признанием. Бетонконтакты от AXTON в ведрах с различным весом для удобства использования по 18,12 и 6 кг. Средства на основе полимерной дисперсии из Германии от GLIMS и адгезионные составы той же торговой марки. Безопасный для здоровья человека «Тифенгрунд» от KNAUF с паропроницаемой способностью и экономичным расходом. Грунты для впитывающих оснований и универсальные варианты от CERESIT в канистрах. Для создания шероховатой текстурыподойдут составы от БОЛАРС, а так же пропитка для предотвращения плесени этого же изготовителя. Многофункциональные средства, разработанные для пола и для стен европейским производителем Vetonit, одним из лидеров в производстве строительных смесей.

Официальный дистрибьютор «Строй Опт» предлагает продукцию от лучших заводов России и международных холдингов, производящих грунтовки в сухом и готовом к использованию виде. Своим клиентам предоставляет выгодные условия сотрудничества и регулярно дополняет ассортимент актуальными товарами для строительства и ремонта. Осуществляет поставки крупным оптом по ценам заводов-изготовителей.

Маркер, пригодный для определения пола птиц из разложившихся образцов

Амплифицированы все 42 протестированных вида птиц, как и морской крокодил (ампликоны = 81–110 п.н., морской крокодил = 110 п.н.; таблица 2). Был успешно определен пол 21 вида (50 %), включая воробьиных, куликов, пастушковых, морских птиц, орлов и коричневых киви (таблица 2). У всех видов с разбивкой по полу диагностический аллель W (81–92 п.н.) был меньше, чем аллель Z (92–100 п.н.; таблица 2). Разница в размере между аллелями W и Z внутри вида была небольшой (2–19 п.н., таблица 2), и для устранения этой разницы потребовался анализатор ДНК ABI.

Было успешно определено половое типирование особей по разложившимся тканям, включая невылупившиеся эмбрионы, мертвые птенцы и музейные подушечки пальцев ног (hihi Notiomystis cincta ), а также по образцам ДНК в небольшом количестве, т. е. выщипанным перьям (hihi, северный глупыш Fulmarus glacialis ) и буккальные мазки (коростель Crex crex ; таблица 2). Лица, чья ДНК была извлечена из неразложившихся образцов крови, также были успешно типированы по полу (таблица 2). Z37B успешно определили половой тип особей, когда они были включены в состав микросателлитного мультиплексного набора (hihi и коростель; неопубликованные данные PB).

Многие виды демонстрировали один аллель (т. е. одинаковый размер) у обоих полов и, следовательно, не могли быть разделены по полу (43 %; таблица 2), вероятно, из-за неспособности амплифицировать локус W (или, возможно, из-за отсутствия различий в размере между ампликонами Z и W). Восемь видов (19 %) демонстрировали полиморфизм в локусе Z, а у трех из этих видов (7 %) все самки были гомозиготными, что позволяет предположить, что локус W не амплифицируется (вероятно, из-за несоответствия оснований праймер-W-хромосомы; таблица 2). У некоторых видов для амплификации локуса W может потребоваться более низкая температура отжига ПЦР, например 50 °C.Мы рекомендуем использовать Qiagen Multiplex Master Mix для ПЦР-типирования пола, поскольку он чаще позволяет проводить амплификацию даже при наличии некоторых несоответствий между мишенью и праймером (неопубликованные данные DAD). Хотя здесь и не возникает ошибки, полиморфизм Z (и/или W) может привести к ошибке при интерпретации полов, если не включены второй маркер типирования пола и/или известные полы (Dawson et al. 2001, Robertson and Gemmell 2006).

Маркер Z37B используется для определения пола разложившихся образцов. Он обеспечивает альтернативный маркер для проверки данных о половом типе.Большинство протестированных видов воробьиных могут быть типированы по полу с помощью этого маркера, что позволяет предположить, что он будет полезен для определения пола многих из примерно 5000 видов в этом порядке. Кроме того, успешное определение пола неворобьиных птиц, включая куликов, пастушковых, морских птиц, орлов и киви, предполагает, что Z37B будет полезен для широкого круга видов.

Birds Trapped in a Cage [[PRIMER]] (командир / EDH MTG Deck)

Если вы ознакомились с другими моими колодами, то увидите, что я люблю племенные или тематические колоды.Если нет, иди посмотри, я дам ссылки в конце описания.

Вот оно! Эта колода — худшая из тех, что я когда-либо строил. Люди возненавидят меня за эту колоду.

Если вы хотите потерять своих друзей, это колода, она почти так же плоха, как Леовольд, Эмиссар Треста

Upvote

INTRO

Это не первая соревновательная колода, которую я сделал, но я думаю, что она самая унизительная колода с . При этом это не ваша средняя колода. Цвета Bant дают нам идеальный набор цветов для колоды в стиле Hate Bears.Белый дает нам доступ ко всем лучшим медведям ненависти, зеленый дает нам доступ ко всем важным пандусам вместе с множеством наставников, а синий дает нам лучшее взаимодействие на основе стека, а также дополнительное преимущество по картам.

Это STAX и контроль, но без особой херни и с сохранением какой-то темы.

Эта колода началась с идеи создания племенной колоды Птиц. Это было не очень мощно, но весело играть. Атака с доской, полной птиц для победы, звучит здорово, но на самом деле не может победить.

Итак, мы подошли к версии 2.0 колоды птиц. Версия 1 — Rain of Feathers [[Primer]]

ПЛАН ИГРЫ

Таким образом, идея колоды состоит в том, чтобы собрать серию фишек ненависти в начале игры, суммируя кумулятивные эффекты различных эффектов, чтобы другие колоды стол изо всех сил, чтобы реализовать свой план игры. Эта колода превосходит быстрые комбо-колоды, основанные на заклинаниях, такие как Zur the Enchanter и Jeleva, Nephalia’s Scourge. Немного слабее комбо-колоды на основе существ, такие как Генерал Тазри и Карадор, Призрачный вождь, потому что, хотя у нас есть инструменты, чтобы разрушить такие колоды, нам не хватает критической массы элементов ненависти для этих стратегий.

Шаг 1: Сначала вы хотите получить защиту и, надеюсь, немного рампы

Шаг 2: План состоит в том, чтобы разыграть какой-нибудь стакс, чтобы заблокировать игровое поле.

Шаг 3: разыграйте своих птиц и летающих существ, чтобы атаковать и победить Авен Создатель Судьбы , Skullclamp, Zendikar Resurgent и Cryptic Command

Utility/Support:

Все это поможет прокачивать и поддерживать жизнь ваших существ.

Крестовый поход катаров, Гравитационный сдвиг, Гнездо ловцов душ , Авен Бригадир , Элеш Норн, Великий Сенобит, Медвежья Умбра и Гнездовые мистики

Рампа:

Так как мы тоже в зеленом, мы можем играть любыми эльфами, какими захотим. Двумя лучшими картами в этой колоде по понятным причинам являются Selvala, Explorer Returned и Shaman of Forgotten Ways.

С рампой у нас также есть вещи, которые удешевляют игру. Это такие карты Страж острова Эвос и Grand Arbiter Augustin IV

Wincon:

Это колода STAX, как и в любой другой подобной колоде, самый большой плюс в том, чтобы заблокировать доску, чтобы только вы могли разыгрывать заклинания и атаковать.Это заполняет большую часть колоды, посмотрите, сможете ли вы остановить их всех.

КОМБО

Я не очень люблю бесконечные комбинации… Они могут сделать игру немного быстрее, но я не хочу выигрывать. Кроме того, со STAX вам не нужны бесконечные комбинации, просто остановите всех остальных пытаясь это сделать.

ВЫИГРЫШ

Эта колода является разновидностью традиционной колоды STAX. Заблокируйте поле боя, чтобы никто не играл и не атаковал вас, а затем раскачивайтесь вместе с птицами.

Я думаю, что играть крайне запутанно.С другой стороны, играть колодой, которую никто не ожидает, всегда весело, и она маскируется под базовую колоду летунов.

EXTRA

Если вам понравилась эта колода, посмотрите мои другие на kryptobrodie Проголосуйте, если вам понравилась эта колода.

Оставьте свои предложения ниже Мне бы хотелось узнать, что все думают об этой колоде.

Спасибо!

[[Учебник]] Селвала — Ведите переговоры, рисуйте, получайте жизнь, выигрывайте

Голгари Архимас (нужны предложения)

Сомешта «Зеленый человек» — АТАКА ДЕРЕВЬЕВ

Поднимаясь из глубин! Кракены атакуют! (Бюджет $40)

Fraking Toaster’s — MYR Tribal

Deadly not Shinny (нужна помощь)

[[Primer]] Selvala, Heart of Timmy Eldrazi Smash

Upvote

Уникальная последовательность гена hmuY как специфический маркер Porphyromonas gingivalis(2013) Уникальная последовательность гена

hmuY в качестве специфического маркера Porphyromonas gingivalis . ПЛОС ОДИН 8(7): е67719. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0067719

Редактор: Игорь Мокроусов, Санкт-Петербургский институт Пастера, Российская Федерация

Поступила в редакцию: 21 февраля 2013 г.; Принято: 21 мая 2013 г.; Опубликовано: 2 июля 2013 г.

Авторское право: © 2013 Gmiterek et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.

Финансирование: Это исследование было поддержано грантом №. N N303 518438 Министерства науки и высшего образования/Национального научного центра (Польша) и Вроцлавского исследовательского центра EIT+ в рамках проекта «Биотехнологии и передовые медицинские технологии – BioMed» (POIG 01.01.02-02-003/08/00) финансируется из Европейского фонда регионального развития (Операционная программа «Инновационная экономика», 1.1.2) (к ТО). Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных и подготовке рукописи. Решение о публикации было принято авторами после рассмотрения интеллектуальной собственности.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Хронический пародонтит — одна из наиболее распространенных бактериальных инфекций человека, характеризующаяся разрушением опорных тканей зубов [1]–[3].С клинической точки зрения пародонтит характеризуется наличием глубоких пародонтальных карманов, возникающих в результате потери прикрепления соединительной ткани и альвеолярного отростка. Выраженность кровоточивости при зондировании зависит от интенсивности воспаления десен. Несколько исследований показали, что около 700 видов способны колонизировать ротовую полость взрослого человека [4]–[8]. Только в поддесневом налете было обнаружено до 400 видов, относящихся к девяти бактериальным типам [9]. Анализ видов бактерий, выделенных из поддесневых образцов, выявил наличие и относительное обилие пародонтальных патогенов, в том числе бактерий «красного комплекса» ( Porphyromonas gingivalis , Tannerella forsythia и Treponema denticola ), ассоциированных с клиническими признаками хронического пародонтита. [5], [10]–[16].Среди нескольких бактерий P. gingivalis считается основным этиологическим агентом и ключевым патогеном, ответственным за возникновение и прогрессирование хронического периодонтита [17], [18]. P. gingivalis может проникать в эпителиальные и иммунные клетки десны и оставаться жизнеспособным и способным к распространению между клетками-хозяевами [19]–[22], что способствует его выживанию в полости рта. Бактерия является составной частью многовидовой биопленки в десневой щели или пародонтальном кармане, что также способствует персистенции бактерий и увеличивает вероятность разрушения тканей пародонта [23], [24]. P. gingivalis является ауксотрофом гема, поэтому поглощение этого соединения имеет важное значение для выживания бактерий и способности вызывать инфекцию. Бактерия получает гем из среды хозяина, используя новую систему hmu , включающую гемофор HmuY и пять дополнительных белков [25]–[28].

Учитывая появляющиеся данные о связи между пародонтальными инфекциями и системными состояниями, такими как сахарный диабет, ревматоидный артрит, сердечно-сосудистые и респираторные заболевания, а также преждевременная низкая масса тела при рождении [29]–[34], обнаружение P.gingivalis также может быть важным для оценки вышеупомянутых состояний. Было продемонстрировано, что пародонтальные патогены, включая P. gingivalis , не только могут колонизировать клетки ротовой полости, но также были идентифицированы в атеросклеротических бляшках коронарных артерий [35], [36].

Для качественного и количественного анализа оральных патогенов использовалось несколько различных методов, включая гибридизацию in situ, ДНК-гибридизацию и количественную ПЦР в реальном времени (кПЦР).Среди них ПЦР в реальном времени является не только чувствительным и надежным, но также быстрым, эффективным и недорогим методом обнаружения патогенов в образцах человека [6], [10], [37]–[39]. Для обнаружения бактерий обычно используют ген 16S рибосомной РНК ( 16S рРНК ), поскольку нуклеотидные последовательности этих генов хорошо консервативны у многих видов бактерий [40], [41]. Однако с помощью этой мишени невозможно провести различие между близкородственными видами. По этой причине несколько других бактериальных последовательностей ДНК были использованы для разработки более специфичных праймеров, таких как ген ДНК-зависимой РНК-полимеразы ( rpoB ) [42, 43] или ген фимбрилина А ( fimA ) [42, 43]. 44].

Для выявления P. gingivalis в полимикробных образцах человека по-прежнему требуются специфические, точные и чувствительные методы, поскольку идентификация этой бактерии важна не только для изучения хронического пародонтита, но и при тяжелых системных состояниях. Кроме того, при полимикробных инфекциях бактерии подвергаются воздействию различных антибиотиков, поэтому требуется разработка чувствительных методов, классифицирующих эти бактерии по видам. С этой целью мы впервые провели обширный филогенетический анализ P.gingivalis белок HmuY и ген hmuY . Затем мы разработали простой, но эффективный анализ для специфического и чувствительного обнаружения P. gingivalis с использованием последовательности гена hmuY . На основании наших результатов кажется, что уникальная последовательность hmuY может служить одним из молекулярных маркеров P. gingivalis .

Материалы и методы

Пациенты и сбор образцов

Использование людей и протокол исследования были одобрены Комитетом по этике Вроцлавского медицинского университета (451/2009) и Комитетом по биоэтике Ягеллонского университета в Кракове (KBET/157/B/2009).Все испытуемые должны были прочитать и подписать письменную форму согласия. Поддесневые образцы были взяты у 66 пациентов с запущенным хроническим пародонтитом (ХП), имеющих не менее 14 зубов (возраст от 32 до 79 лет). Контрольную группу составили 40 здоровых контрольных (НК) лиц (возраст от 22 до 51 года). Было проведено как клиническое, так и рентгенологическое обследование. Оценка пародонта проводилась с помощью оценки уровня гигиены по индексу аппроксимального зубного налета (API %) [45], а уровня воспаления по индексу кровоточивости борозды (SBI %) [45].Диагностика пародонтита основывалась на рекомендациях стандартов определения заболеваний пародонта [46]. Для оценки тяжести пародонтита оценивали зондирование глубины кармана и вовлечение фуркаций. Затем с учетом этих двух показателей рассчитывали пародонтальный индекс риска инфекционности (PIRI) [47]. Образцы у пациентов с хроническим пародонтитом были взяты из активных участков (глубина пародонтального кармана ≥5 мм в интерпроксимальных участках и кровотечение при зондировании).Критериями исключения из исследования были: здоровый пародонт, менее 14 зубов (что позволяет лучше диагностировать пародонтит и оценить PIRI), курение, беременность и кормление грудью, наличие системных заболеваний, общее лечение антибиотиками и лечение пародонта (скейлинг и/или кюретаж). ) в течение двух месяцев до начала расследования. Образцы от здоровых субъектов без пародонтальных карманов и признаков воспаления и потери прикрепления в любых местах также были собраны в качестве контроля. В группе пациентов с хроническим пародонтитом (ХП) поддесневые образцы брали стерильной кюреткой из наиболее глубоких пародонтальных карманов, а в контрольной группе (КП) — из молярных/премолярных межзубных промежутков.Все образцы помещали в пробирки Эппендорф, содержащие стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS), и хранили при –20°C до дальнейшего анализа.

Бактериальные штаммы и условия роста

P. gingivalis W83 культивировали анаэробно в бульоне Шедлера (SB, Biocorp, Польша), как описано ранее [48]. Bacteroides fragilis NCTC 9343 поддерживали в бульонной среде Brain Heart Infusion (BHI, Biocorp) с добавлением 0,5% дрожжевого экстракта и 15 мкг/мл гемина при 37°C в анаэробных условиях (10% H 2 , 5% CO 2 и 85% N 2 ). Prevotella intermedia 17 и Tannerella forsythia ATCC 43037 выращивали в триптическом соевом бульоне (TSB, Biocorp) с 0,5% дрожжевым экстрактом, 0,05% цистеином, 0,5 мг/мл гемина и 2 мкг/мл витамина К при 37°C при анаэробные условия.

Поиск в базе данных гомологов HmuY и филогенетических анализов

Для получения основных сведений о разнообразии и эволюции P. gingivalis hmuY и его гомологов, необходимых для разработки ПЦР-обнаружения этого вида на основе этого гена, мы провели обширный филогенетический анализ.Чтобы собрать все потенциальные гомологи P. gingivalis HmuY, доступные в базах данных последовательностей, были проведены всесторонние поиски в GenBank различными способами. Гомологи были собраны в соответствии с онлайн-поиском Psi-Blast с E-value <0,005 и локальными поисками в базе данных консервативных доменов [49] для домена HmuY с каждой последовательностью, присутствующей в базе данных неизбыточных белков. Все последовательности, аннотированные как «HmuY», также были извлечены из GenBank. После исключения избыточных последовательностей из объединенного набора 258 последовательностей демонстрируют значительное сходство с доменом HmuY с E-значением ≤0.005 были выбраны. Неполные или фрагментарные последовательности были исключены из дальнейшего анализа. Наконец, были отобраны 103 аминокислотные последовательности, представляющие все филетические линии для вывода глобальных филогенетических деревьев. Кроме того, мы реконструировали подробные филогенетические деревья на основе аминокислотных и нуклеотидных последовательностей всех доступных ближайших гомологов к P. gingivalis HmuY, включая новые последовательности, выделенные в этом исследовании у людей. Аминокислотные выравнивания были получены в MAFFT 6.925b с использованием медленного и точного алгоритма L-INS-i с 1000 циклами итеративного уточнения [50] и редактировались вручную в JalView [51]. Нуклеотидные последовательности ближайших гомологов к P. gingivalis HmuY были выровнены в соответствии с их аминокислотным выравниванием.

Филогенетические деревья на основе аминокислотных последовательностей были выведены с помощью байесовского подхода в PhyloBayes 3.3e [52], а также метода максимального правдоподобия, используемого в TreeFinder [53] и morePhyML 1.14 с использованием PhyML 3.0 [54], [55].В PhyML мы применили модель LG+Γ(5) аминокислотных замен при реконструкции глобального дерева и модель LG+F+Γ(5) при выводе дерева для ближайших гомологов HmuY. Модели подбирались согласно ProtTest 3.2 [56] с учетом оптимизации моделей, ветвей и топологии дерева. В подходе TreeFinder мы применили модель MIX+F+Γ(5) для глобальной реконструкции дерева и модель LG+F+Γ(5) для дерева ближайших гомологов HmuY. Модели были выбраны в соответствии с модулем Propose Model в этой программе, предполагая оптимизированные частоты аминокислот.В анализе PhyloBayes мы приняли модель LG+Γ(5) для реконструкции двух деревьев. Две независимые цепи Маркова были пропущены через 200 000 циклов при выводе глобального дерева и 100 000 циклов при реконструкции дерева для ближайших гомологов HmuY. После получения сходимости были собраны последние 100 000 и 50 000 деревьев из каждой цепочки соответственно для вычисления апостериорного консенсуса.

Вывод филогенетических деревьев на основе шести подходов к выравниванию нуклеотидов с использованием пяти программ — MrBayes 3.2.1 [57], PhyloBayes 3.3e [52], TreeFinder [53], morePhyML 1.14 на базе PhyML 3.0 [54], [55] и PAUP* 4.0b [58]. В анализе MrBayes мы предположили три отдельные смешанные+I+Γ(5) модели для трех позиций кодонов, чтобы отобрать соответствующие модели в пространстве моделей замещения в самом байесовском анализе MCMC [59], избегая необходимости априорного тестирования модели. В этом анализе применялись два независимых прогона, начиная со случайных деревьев, в каждом из которых использовалось 4 цепи Маркова. Образцы деревьев отбирали каждые 100 поколений в течение 10 000 000 поколений.В конечном анализе были выбраны деревья из последних 5 007 000 поколений, которые достигли стационарной фазы и конвергенции (, т.е. , стандартное отклонение расщепленных частот стабилизировалось и стало ниже 0,005, что намного ниже предложенного порога 0,01). В подходе PhyloBayes две независимые цепи Маркова были запущены для 500 000 циклов, предполагая модель CAT Poisson+Γ(5) с числом компонентов, весами и профилями, выведенными из данных. После получения сходимости были собраны последние 200 000 деревьев из каждой цепочки для вычисления апостериорного консенсуса.В реконструкции дерева TreeFinder мы применили отдельные модели замены для трех позиций кодона — HKY+Γ(5) (для первой позиции кодона), HKY (для второй позиции кодона) и HKY+Γ(5) (для третьей позиции кодона). position) – как предложено модулем Propose Model этой программы. Дерево, полученное с помощью (more)PhyML, а также деревья максимальной вероятности и объединения соседей, рассчитанные в PAUP, были основаны на модели подстановки наилучшего соответствия 012034+F+Γ(5), найденной в jModeltest 2.1 [60] среди 1624 моделей-кандидатов.

Для выравнивания аминокислот и нуклеотидов была применена глубина поиска, установленная на 2 в TreeFinder, и лучшие алгоритмы эвристического поиска, NNI и SPR, в (more)PhyML. В методе максимального правдоподобия в PAUP конечное дерево искали из 10 начальных деревьев, полученных путем пошагового и случайного сложения последовательностей с последующим алгоритмом замены ветвей дерева пополам (TBR). Поддержка Edge оценивалась с помощью бутстрап-анализа с 1000 повторений в каждой из этих трех программ.

Экстракция ДНК, стандартная амплификация полимеразной цепной реакцией (ПЦР) и секвенирование ДНК

Тотальную геномную ДНК экстрагировали непосредственно из образцов человека или бактериальных культур с помощью набора NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel, Германия) в соответствии с инструкциями для труднолизируемых бактерий. Концентрацию и чистоту ДНК определяли спектрофотометрически с использованием спектрофотометра УФ-видимого диапазона (NanoPhotometer Pearl; Implen, Германия).

Нуклеотидные последовательности последовательностей генов hmuY P.gingivalis (381, ATCC 33277, W50, W83, A7436, TDC60) и их фланкирующие участки были получены из базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI). Для секвенирования всего гена hmuY , извлеченного из изолятов, присутствующих в ротовой полости человека, были разработаны праймеры (все праймеры, использованные в этом исследовании, были синтезированы Genomed, Польша) для стандартной ПЦР для фланкирующих или внутренних областей гена (таблица 1). ). Продукты ДНК амплифицировали с использованием геномной ДНК и стандартной ПЦР (Biometra, Германия) в следующих условиях: начальная денатурация при 94°С в течение 5 мин и 35 циклов денатурации при 94°С в течение 30 с, отжиг праймеров при 64°С в течение 30 с. с, удлинение при 72°С в течение 1 мин и окончательное удлинение при 72°С в течение 5 мин.Реакционная смесь содержала 2×PCR Master MixPlus (A&A Biotechnology, Польша), по 40 пмоль каждого обратного и прямого праймеров и 5 мкл матрицы (конечный объем 50 мкл). Аликвоты по 45 мкл ПЦР-реакционной смеси разделяли на 1,5%-ных агарозных гелях в присутствии бромистого этидия в буфере ТАЕ (4 мМ Трис-ацетат, 1 мМ ЭДТА) при 100 В в течение 25 мин. Продукты амплификации выделяли с помощью набора Gel Out (A&A Biotechnology) и секвенировали (Genomed).

Набор праймеров для эксклюзивной амплификации P.gingivalis hmuY были сконструированы на основе нуклеотидных последовательностей гена (табл. 1 и рис. 1). Специфичность праймеров исследовали с помощью стандартной ПЦР с использованием геномной ДНК или бактериальных культур в качестве матрицы. Для эффективной денатурации ДНК бактериальные клетки сначала добавляли в воду и нагревали при 100°С в течение 1 мин, а затем добавляли все реагенты. ПЦР проводили в следующих условиях: начальный цикл денатурации при 94°С в течение 5 мин и 35 циклов денатурации при 95°С в течение 30 с, отжиг праймеров при 64°С в течение 30 с, удлинение при 72°С в течение 1 мин и окончательное удлинение при 72°С в течение 5 мин.Аликвоты по 15 мкл реакционной смеси для ПЦР разделяли на 1,5% агарозном геле в присутствии бромистого этидия и визуализировали с помощью системы GelDoc (Bio-Rad, США). В качестве эталона использовали обычно используемый набор праймеров на основе гена 16S рРНК P. gingivalis (области, соответствующие положениям нуклеотидов +648 и +667 или +1006 и +1025) (таблица 1) с условиями ПЦР, описанными Maeda. и др. [61]. Продукты амплификации разделяли в 1,5% агарозных гелях, выделяли и секвенировали (Геномед).

Рисунок 1. Сравнение нуклеотидных последовательностей гена hmuY , идентифицированных в последовательностях, депонированных в базе данных.

Последовательности в серых прямоугольниках с жирными стрелками ниже показывают набор праймеров на основе генов hmuY (HYq4-F и HYq4-R), используемых для обнаружения желаемой мишени. Тонкими стрелками показаны другие последовательности праймеров, проверенные на предварительном этапе, но не использованные в окончательных экспериментах из-за перекрестной реактивности с другими мишенями. Номера доступа и варианты последовательности ДНК гена hmuY (Y и W) перечислены в таблице.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0067719.g001

ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени проводили на термоциклере Stratagene Mx3005P (Agilent Technologies, США). Амплификацию проводили в трех повторностях в 15-мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл ДНК, выделенной из бактериальных культур или образцов человека, 20 пмоль каждого праймера и 2×Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Амплификацию проводили в следующих условиях: начальная денатурация при 94°С в течение 10 мин и 40 циклов денатурации при 95°С в течение 20 с, отжиг праймеров при 64°С в течение 15 с, удлинение при 72°С в течение 20 с.Регистрировали графики амплификации и определяли специфичность реакции с помощью анализа кривой денатурации в интервале температур 65–94°С. ПЦР-амплификацию в реальном времени с использованием праймеров на основе гена 16S рРНК P. gingivalis (таблица 1) проводили, как описано Maeda et al. [61]. Тест на чувствительность праймеров проводили с использованием стандартной кривой, полученной с помощью количественной ПЦР 5-кратных разведений геномной ДНК, выделенной из штамма P. gingivalis W83 в условиях, описанных выше.Общее количество бактериальных клеток определяли количественно с использованием универсального набора праймеров (табл. 1), разработанного на основе бактериальных генов 16S рРНК в условиях, описанных Maeda et al. [61]. Количество P. gingivalis или общее количество бактериальных клеток определяли в 5 мкл первоначально выделенных образцов геномной ДНК и рассчитывали по стандартной кривой, полученной с использованием геномной ДНК, выделенной из штамма P. gingivalis W83.

Статистический анализ

Клинические параметры обследованных и количество бактериальных клеток в пробах человека анализировали с помощью теста Манна-Уитни-Уилкоксона.Рассчитывали коэффициенты корреляции Пирсона и для оценки наличия связи между исследуемыми параметрами применяли корреляционные тесты и использовали уровень значимости α = 0,005. Кроме того, для оценки связи между рассматриваемыми переменными применялась линейная регрессия. Чтобы найти модель, лучше всего соответствующую данным, использовался информационный критерий Акаике (AIC). Наилучшей моделью оказалась следующая: Y = 0,25779+0,01202×X1+0,28933×X2, где Y — индекс изолята, равный 1, 2, 3 и 0 для 381/ATCC 33277, W50/W83/A7436, TDC60 ( штаммы перечислены в соответствии с их возрастающей вирулентностью), а P.gingivalis не обнаружен, соответственно X1 представляет собой SBI, а X2 обозначает PIRI. Для проверки значимости конкретного коэффициента регрессии использовался уровень значимости α = 0,005. Статистический анализ был выполнен с использованием статистического пакета R (R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Core Team, www.r-project.org). Данные, полученные в результате количественной ПЦР, анализировали с использованием программного обеспечения Stratagene MxPro (Agilent Technologies).

Результаты и обсуждение

пациентов

Клинические характеристики всех субъектов, включенных в это обследование, показаны в таблице 2.В группе больных хроническим пародонтитом (ХП) гигиена полости рта была в основном неудовлетворительной. Величина API находилась в пределах 14-22% только у 7 пациентов, а у остальных колебалась от 26% до 100%. Индекс кровотечения был ниже 15% только у 10 пациентов. У остальных пациентов этот показатель был от 17% до 100%, а индекс PIRI от 1 до 8. В группе пародонтита 17% больных были отнесены к группе высокого риска контагиозности (PIRI от 6 до 10). В контрольной группе (НК) значение индекса API было от 0% до 70%, индекса SBI от 0% до 31%, а значение индекса PIRI было равно 0 (за исключением одного субъекта со значением 2, связанным с наличием 2 фуркации).Статистически значимые различия были обнаружены между пациентами и здоровыми субъектами в отношении API, SBI и PIRI ( P <0,001).

Филогенетический анализ и изменение последовательности

HmuY

Целью данного исследования была разработка ПЦР-анализа в реальном времени на основе гена hmuY с использованием химии SYBR Green для обнаружения P. gingivalis в полимикробных образцах человека. Для достижения этой цели знания о разнообразии и эволюции нуклеотидных и аминокислотных последовательностей P.gingivalis HmuY и его гомологов у других бактерий, особенно у тех, которые присутствуют в полости рта. Поэтому мы сначала тщательно собрали все значимые гомологи P. gingivalis HmuY и провели глобальный филогенетический анализ на основе набора 103 репрезентативных белковых последовательностей (рис. S1). Хотя подавляющее большинство гомологов HmuY было обнаружено среди Bacteroidetes, последовательности также были представлены γ- и δ-протеобактериями, а также спирохетами. Единичные случаи последовательностей HmuY были обнаружены у β-Proteobacteria, Gemmatimonadetes и родственных Bacteroidetes, Ignavibacteria и Chlorobi.Интересно, что об одном значительном поражении HmuY сообщил некультивируемый эвриархеот, выделенный из морского метагенома и классифицированный в морской группе II.

Хотя глубокие ветви полученных деревьев, как правило, плохо подтверждались бутстрап-анализом из-за очень высокого расхождения проанализированных последовательностей, многие из одних и тех же клад были восстановлены деревьями, полученными с помощью разных методов (рис. S1). Большинство последовательностей Bacteroidetes образуют одну большую кладу и четко отделены от последовательностей протеобактерий, занимающих базальное положение в дереве.Интересно, что некоторые последовательности из разных таксономических групп были сгруппированы вместе, что предполагает горизонтальный перенос hmuY между бактериями. Такие кластеры были созданы δ-Proteobacteria и Spirochaetes, Bacteroidetes и δ-proteobacterium Sorangium Cellulosum So ce56, Spirochaetes и Bacteroidetes. Последовательности из трех классов Bacteroidetes, Cytophagia, Flavobacteria и Sphingobacteria, были распределены в две клады, разделенные последовательностями из Bacteroidia (и некоторых Flavobacteria).Такая топология дерева указывает на древнее дублирование hmuY до расхождения основных линий Bacteroidetes. Дополнительные, более поздние дупликации этого гена также должны были произойти, потому что многие штаммы были представлены более чем одной близкородственной копией гена (например, Capnocytophaga gingivalis ATCC 33624 четырьмя копиями и Pedobacter sp. BAL39 пятью копиями). Наличие нескольких копий hmuY предполагает некоторую функциональную дифференциацию их продуктов, что должно быть подтверждено экспериментальными исследованиями.HmuY из P. gingivalis (вместе с двумя последовательностями P. asaccharolytica DSM 20707) был помещен в основу других последовательностей Bacteroidia, представленных Bacteroides , Prevotella и Tannerella (рис. ).

Для детального изучения филогенетических взаимоотношений между P. gingivalis HmuY и его ближайшими гомологами были проведены дополнительные анализы, основанные как на аминокислотном (рис. 2), так и на нуклеотидном (рис. 3) выравнивании, включая новые последовательности, выделенные от обследованных пациентов. в этом исследовании.С этой целью весь ген hmuY был амплифицирован с использованием геномной ДНК, выделенной из образцов человека. Впоследствии известные нуклеотидные последовательности hmuY , депонированные в базах данных, сравнивали с данными, полученными в результате секвенирования. Все последовательности Porphyromonas четко отделены от других последовательностей Bacteroidia с высокой и умеренной поддержкой (рис. 2). Одна последовательность с неустановленной таксономической принадлежностью описана как оральный таксон Bacteroidetes 274 str. F0058 (ZP_06981969.1) был сгруппирован с последовательностями Porphyromonas , что позволяет предположить, что он может представлять неизвестный до сих пор таксон Porphyromonas . Интересно, что P. asaccharolytica DSM 20707 и P. uenonis 60-3 были представлены тремя гомологами HmuY, которые были распределены по трем значительно поддерживаемым кладам. Каждая из этих ветвей включала одну последовательность из этих двух видов, что указывает на то, что до дивергенции этих таксонов должны были произойти две дупликации генов.Однако для P. gingivalis не было обнаружено дополнительных гомологов HmuY, хотя четыре генома этого вида (W83, ATCC 33277, TDC60, JCVI SC001) были полностью секвенированы. Все проанализированные последовательностей P. gingivalis создали одну значительную монофилетическую группу, демонстрирующую очень небольшое расхождение на уровне аминокислот. Многие из исследованных последовательностей были идентичны и различались не более чем по четырем сайтам (минимальная идентичность составила 98,1%). Среди 58 проанализированных последовательностей только 12 были уникальными. В отличие от этого, идентичность между последовательностями P.gingivalis и других видов Porphyromonas была значительно меньше и в среднем равнялась 38,0% (мин.: 33,8%, макс.: 49,8%). Это указывает на очень высокую скорость эволюции HmuY между P. gingivalis и другими видами Porphyromonas , но очень низкую среди штаммов или изолятов P. gingivalis .

Рис. 2. Дерево PhyloBayes, основанное на аминокислотном выравнивании ближайших гомологов к P. gingivalis HmuY.

Клада P.gingivalis и изоляты отмечены серым прямоугольником. Объединенные названия штаммов и изолятов указывают на их 100% идентичность последовательностей. Числа в узлах в указанном порядке соответствуют апостериорным вероятностям, оцененным в PhyloBayes (PB), а также значениям начальной загрузки, рассчитанным в PhyML (PH) и TreeFinder (TF). Значения апостериорных вероятностей и бутстреп-процентов ниже 0,50 и 50% соответственно опускались или обозначались прочерком «–».

https://дои.org/10.1371/journal.pone.0067719.g002

Рисунок 3. Дерево MrBayes, основанное на нуклеотидном выравнивании ближайших гомологов к P.

gingivalis hmuY A) Общее дерево с реальной длиной ветви, ведущей к P. endodontalis от общего предка клады P. gingivalis (отмечено серым прямоугольником). B) Дерево с длиной ветви, ведущей к P. endodontalis , укорочено в 100 раз (пунктирная линия), чтобы показать подробные отношения между P.gingivalis штаммов и изолятов. Объединенные названия штаммов и изолятов указывают на их 100% идентичность последовательностей. Числа в узлах в указанном порядке соответствуют апостериорным вероятностям, оцененным в MrBayes (MB) и PhyloBayes (PB), а также значениям начальной загрузки, рассчитанным в PhyML (PH), TreeFinder (TF) и PAUP с использованием максимального правдоподобия (ML) и методы присоединения к соседям (NJ). Значения апостериорных вероятностей и бутстреп-процентов ниже 0,50 и 50% соответственно опускались или обозначались прочерком «–».

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0067719.g003

Этот вывод более выражен на уровне нуклеотидов. Стандартный поиск в GenBank гомологов P. gingivalis hmuY не обнаружил каких-либо нуклеотидных последовательностей других видов Porphyromonas , даже если предполагалось, что наименьший размер слова = 7 повышает чувствительность. Филогенетический анализ этих последовательностей выявил очень большое расстояние (в среднем почти 1,7 нуклеотидных замены на сайт) между чистой кладой P.gingivalis hmuY и их ближайший гомолог из P. endodontalis (рис. 3). В полученных деревьях последовательности из P. gingivalis оказались очень однородной и малоразнообразной группой. Минимальная идентичность между этими последовательностями составляла всего 98,1%, а максимальная разница составляла всего 12 позиций (рис. S2, таблица S1). Среди 58 проанализированных последовательностей только 32 были уникальными. Для сравнения, последовательности P. gingivalis отличались от гомолога P. endodontalis в среднем по 269 позициям (мин.: 265, макс.: 274). Средняя идентичность этим последовательностям составила 55,8% (мин.: 55,0%, макс.: 56,5%).

Эти результаты показывают, что потенциальное происхождение амплифицированных образцов последовательностей hmuY от видов, отличных от P. gingivalis , крайне маловероятно, поскольку полученные последовательности почти идентичны другим последовательностям, независимо классифицированным другими авторами, а также P. gingivalis. . Некоторые из этих последовательностей получены из полностью секвенированных штаммов, которые должны были быть чистыми и хорошо охарактеризованными культурами.Кроме того, высокая идентичность последовательности гена hmuY между штаммами или изолятами P. gingivalis по сравнению с низким сходством последовательности с его гомологами, обнаруженными у других бактерий, демонстрирует, что инвариантные фрагменты последовательности ДНК, кодирующие этот ген, могут быть успешно использованы. разработать праймеры для специфического обнаружения P. gingivalis в полимикробных образцах человека. Поэтому набор праймеров (HYq4-F и HYq4-R) был разработан для сопоставления областей, которые являются высококонсервативными среди депонированных в базе данных последовательностей генов hmuY (рис.S2), но отличается от гомологов HmuY, кодируемых другими видами бактерий (рис. 2, 3 и рис. S1). Действительно, последовательность обратного праймера, посвященного гену P. gingivalis hmuY , отличается от ближайшего гомолога P. endodontalis по семи позициям, тогда как она одинакова у всех проанализированных штаммов и изолятов P. gingivalis (рис. С2). В случае прямого праймера в гомологе P. endodontalis имеется шесть различных положений по сравнению с P.gingivalis и только два уникальных изолята последовательности P. gingivalis (, т.е. CP31 и NP25/NP36) показали один переход G→A (рис. S2). Специфичность разработанных праймеров может быть подтверждена поиском Blastn в базах данных последовательностей с использованием праймеров в качестве запроса. Хотя при поиске были обнаружены бактериальные последовательности со 100% идентичностью по длине 18 нуклеотидов ( Spirosoma linguale ) или 17 нуклеотидов ( Streptococcus agalactiae , Naumovozyma castellii , Serratia ) и с 95% идентичностью по всей длине 20 н. ( Azospirillum lipoferum , Bacteroides salanitronis ), они показали сходство только по одному праймеру на таксон.Каждый из двух праймеров показал 100% идентичность на длине 16 нуклеотидов с полным геномом Hahella chejuensis . Однако найденные последовательности были разделены почти на 250 т.п.н. и не могли амплифицировать даже этот длинный участок, поскольку имели внешнюю (а не внутреннюю) ориентацию друг к другу и к этому участку.

Мы также выполнили in silico анализов разработанных праймеров с использованием mFOLD [62] при температуре складывания ( т.е. отжига) 64°C. Полученные результаты показали, что образование потенциальных вторичных структур в этих праймерах крайне неблагоприятно.Изменение свободной энергии Гиббса (ΔG) составило 0,26 ккал/моль, -0,82 ккал/моль, 0,91 ккал/моль и -0,98 ккал/моль для праймеров HYq4-F (внутренняя шпилька), HYq4-R (внутренняя шпилька), fHYb2- F (3′-концевая шпилька) и HYAGf2–R (внутренняя шпилька) соответственно. Эти значения намного превышают предполагаемые пороговые значения для дизайна праймера SYBR Green, т. е. -3 ккал/моль и -5 ккал/моль для 3′-концевой и внутренней шпилечных структур соответственно. Следовательно, влияние этих структур на чувствительность праймеров незначительно.

Экспериментальный анализ специфичности и чувствительности разработанных праймеров

Стандартная ПЦР и ПЦР в реальном времени в настоящее время широко используются для выявления патогенов при инфекциях человека; поэтому в этом исследовании мы разработали набор праймеров для специфического обнаружения P.десна . В качестве контроля использовали отобранные штаммы, принадлежащие к Bacteroides, Prevotella и Tannerella , обладающие ближайшими гомологами HmuY, а именно B. fragilis и два пародонтопатогена, P. intermedia и T. forsythia . Специфичность праймеров HYq4-F и HYq4-R сначала тестировали с использованием стандартной ПЦР и геномной ДНК, выделенной из штамма P. gingivalis W83 и других исследованных видов бактерий. Данные показали, что отдельный продукт ПЦР ожидаемого размера (214 п.н.) амплифицировался только в случае P.gingivalis (рис. 4А и 4D). Чтобы подтвердить присутствие P. gingivalis , были проведены аналогичные эксперименты, но с использованием праймеров на основе гена 16S рРНК P. gingivalis , отобранных в результате литературного поиска [6], [39], [41], [63]–[ 65] и наши предварительные эксперименты (данные не показаны). В заключительных экспериментах мы использовали праймеры, разработанные Maeda et al. [61] по следующим причинам: 1) последовательности праймеров были получены из консервативной внутренней области P.gingivalis 16S рРНК гена, 2) праймеры были разработаны для амплификации коротких последовательностей ДНК, пригодных для ПЦР-анализа в реальном времени, 3) праймеры позволили получить продукты амплификации самого высокого качества по сравнению с другими протестированными праймерами, 4) вариабельность соответствующих точек в стандарте кривых с использованием ДНК, выделенной только из P. gingivalis , а также стандартной кривой с использованием ДНК, выделенной из P. gingivalis и контаминирующих штаммов, было очень мало по сравнению с другими наборами праймеров, 5) образцы были собраны таким же образом, как и в наше исследование.Результаты экспериментов, проведенных с праймерами, разработанными Maeda et al. [61] показал амплификацию желаемой мишени ожидаемого размера (387 п.н.) в случае P. gingivalis (рис. 4Б и 4Е). Однако некоторые неспецифические продукты амплификации были получены с использованием ДНК, выделенной из других видов или целых бактериальных культур этих видов.

Рис. 4. Специфичность праймеров на основе hmuY , проанализированная с помощью стандартной ПЦР.

Фрагменты ДНК

амплифицировали с использованием геномной ДНК (A, B и C) или бактериальных культур (D, E и F) и разделяли в агарозных гелях.Дорожки: 1) ДНК-маркер 100 п.н., 2) P. gingivalis W83, 3) T. forsythia ATCC 43037, 4) P. intermedia 17, 5) B. fragilis NCTC 9343. Получены продукты амплификации. с использованием праймеров на основе генов hmuY (A и D), праймеров на основе генов P. gingivalis 16S rRNA (B и E) и универсальных праймеров на основе генов 16S RNA (C и F) [61].

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0067719.g004

Тест на специфичность праймеров на основе генов hmuY также проводили с использованием ПЦР в реальном времени с SYBR Green chemistry.Анализ кривой денатурации показал, что неспецифические продукты ПЦР не амплифицировались, поскольку острый пик при ожидаемой Т m (82,87±0,23) наблюдался только при использовании в качестве матрицы геномной ДНК P. gingivalis (рис. 5А). . Аналогичные эксперименты, проведенные с праймерами, специфичными для гена 16S рРНК P. gingivalis [61], привели к амплификации специфического продукта при исследовании P. gingivalis (T m  = 85,77°C). Однако, как показано на рис.5В, пик при той же Т m (85,30°С), но с меньшей интенсивностью, наблюдался для B. fragilis . В случае P. intermedia был виден пик при более низкой температуре m (79,55°C). Наши данные показали, что праймеров на основе гена 16S рРНК могут быть менее специфичными для обнаружения P. gingivalis по сравнению с праймерами на основе гена hmuY .

Рис. 5. Специфичность праймеров на основе гена P. gingivalis hmuY , проанализированная с помощью количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР).Фрагменты ДНК

амплифицировали с использованием геномной ДНК и праймеров на основе генов P. gingivalis hmuY (A), праймеров на основе генов P. gingivalis 16S rRNA (B) и универсальных праймеров на основе генов 16S RNA ( В) [61].

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0067719.g005

Тест на чувствительность праймеров на основе генов P. gingivalis hmuY проводили с использованием количественной ПЦР с 5-кратными разведениями геномной ДНК, выделенной из P .gingivalis W83, формирующий стандартную кривую (данные не показаны). Набор праймеров на основе гена hmuY , разработанный в этом исследовании, обнаружил всего 0,41 фг геномной ДНК P. gingivalis в образцах объемом 5 мкл, а амплификация была линейной в диапазоне от 4 нг до 10,2 фг. Предполагая, что размер генома P. gingivalis W83 составляет 2,34 Мб, набор праймеров обнаружил 10,2 фг геномной ДНК P. gingivalis , а графики амплификации показали минимальный предел 3.99 клеток из P. gingivalis W83 в 5 мкл образцов ДНК. Используя метод зонда TaqMan и праймеры, разработанные для консервативного гена, кодирующего липополисахарид, Hyvarinen et al. [66] показали, что предел обнаружения праймеров для кПЦР составляет 40 фг геномной ДНК P. gingivalis . Лайонс и др. [39] сообщил количественный диапазон клеток P. gingivalis как 10 2 –10 8 клеток с использованием вложенной ПЦР с зондом TaqMan и праймерами на основе гена 16S рРНК .Хотя метод TaqMan считается более специфичным по сравнению с методом SYBR Green, несколько исследований продемонстрировали, что последний можно разумно использовать в исследованиях пародонтальных патогенов. Парк и др. [43] выявили 4 фг геномной ДНК P. gingivalis с использованием праймеров, разработанных для гена rpoB , и количественной ПЦР с использованием красителя. Используя методы TaqMan и SYBR Green с праймерами на основе генов 16S рРНК , Sakamoto et al. [6] продемонстрировали количественное определение пяти пародонтальных бактерий в диапазоне 10 3 –10 8 клеток, а Maeda et al. [61] выявил три вида пародонта в диапазоне 10–10 7 клеток, в то время как количественный диапазон для всех бактерий составил 10 2 –10 7 клеток. В совокупности наши данные показали, что набор праймеров, основанный на последовательности гена hmuY , является высокоспецифичным и чувствительным для обнаружения P. gingivalis .

Обнаружение

P. gingivalis в пробах человека

Для обнаружения P. gingivalis в образцах человека использовали первую стандартную ПЦР с набором праймеров на основе генов hmuY .Как и ожидалось, P. gingivalis были идентифицированы в большинстве образцов, взятых у пациентов с хроническим пародонтитом (ХП, 77,3%, n = 51), по сравнению с контрольными субъектами, у которых не было заболеваний пародонта (NP, 20%, n = 8). ) (фиг. 6A и 6D, данные не показаны). Эти результаты были подтверждены стандартной ПЦР с использованием праймеров на основе гена 16S рРНК P. gingivalis , разработанных Maeda et al. [61]. Однако последний набор праймеров был менее специфичным, так как при добавлении амплификации целевой последовательности ДНК также продуцировались некоторые неспецифические продукты (рис.6В и 6Е, и данные не показаны).

Рисунок 6. Обнаружение P. gingivalis в образцах, взятых у человека.

Для амплификации желаемых мишеней использовали стандартную ПЦР (A, B и C) и кПЦР (D, E и F) с геномной ДНК в качестве матрицы. Амплификацию проводили с праймерами на основе генов P. gingivalis hmuY (A и D), праймерами на основе генов 16S рРНК P. gingivalis (C и E) и универсальными праймерами на основе генов 16S РНК (D и F). ) [61]. Образцы NP23 и NP26 от репрезентативных контрольных здоровых людей, содержащих P.десневой ; CP43 и CP66, образцы от репрезентативных пациентов с хроническим периодонтитом, содержащие P. gingivalis .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0067719.g006

Накопление продуктов неспецифической амплификации с использованием праймеров на основе гена 16S рРНК P. gingivalis может привести к неверной оценке количества P. gingivalis клетки и приводят к ложноположительным результатам. Таким образом, чтобы продемонстрировать предполагаемое применение праймеров на основе генов hmuY для определения P.gingivalis в образцах человека использовали количественную ПЦР. Для этой цели результаты амплификации 3 серийных разведений ДНК, выделенной из образцов поддесневой ткани человека в линейном диапазоне анализа, усредняли и сравнивали со стандартной кривой, полученной в ходе того же эксперимента. Несколько исследователей сообщили о корреляции между числом клеток P. gingivalis и состоянием здоровья пародонта, демонстрируя, что поздняя стадия пародонтита может быть связана с более высоким количеством этой бактерии.Нашей целью было проверить такие результаты, проверить, насколько общим является это правило, и справедливо ли оно также в изученных нами случаях с использованием вновь разработанного набора праймеров. Наши результаты показали, что по сравнению со здоровыми людьми, имеющими P. gingivalis (2,12×10 4 ±1,74×10 4 , диапазон 2,37×10 5 –6,74×10 7 ), у пациентов с хроническим пародонтитом обладают более высокой численностью этой бактерии (1,61×10 6 ±2,49×10 6 , диапазон 2,70×10 6 –2.16×10 9 ). Мы также определили общее количество бактериальных клеток, используя универсальные праймеры, разработанные Maeda et al. [61]. Универсальный набор праймеров позволял проводить ПЦР-амплификацию, когда в качестве матрицы использовали ДНК, выделенную из P. gingivalis или других исследованных бактерий, а также целые бактерии и ДНК, выделенную из образцов человека (рис. 4В, 4Е, 5В, 6В, и 6F). Общее количество бактериальных клеток полости рта, оцененное с помощью количественной ПЦР и универсальных праймеров, было выше в образцах, полученных от пациентов (9.93×10 9 ±1,03×10 10 , диапазон 2,14×10 8 –3,08×10 10 ), по сравнению с образцами, полученными от контрольных субъектов (7,88×10× 9 ±9,63 , диапазон 5,37×10 7 –3,04×10 10 ). Как и в литературных данных [5], [10]–[14], количество клеток P. gingivalis , а также общее количество бактериальных клеток, определенных в каждом образце, варьировало на несколько порядков. Поэтому к этим данным следует относиться с осторожностью и учитывать следующие причины.На определение абсолютного количества бактериальных клеток с помощью количественной ПЦР может влиять вариация числа копий гена 16S рРНК у данного вида, поскольку было показано, что оно может варьировать от 1 до 15 [67]–[72], и в этом исследовании мы предполагали наличие 4 копий у всех бактерий. Таким образом, общее количество бактерий, оцениваемое по количеству 16S рДНК, может колебаться в полимикробных образцах. Количественная оценка с помощью qPCR также требует знания размера генома, и, поскольку эта информация неизвестна для многих бактерий ротовой полости, мы предположили, что размер генома других бактерий был подобен P.десна . Кроме того, различия в количестве бактерий вызваны различными используемыми методами отбора проб, а уровни бактерий, проанализированные в поддесневых образцах, являются средними значениями, обычно намного выше в местах активности заболевания. В нашем исследовании такой эффект может быть вызван также сравнением контрольной группы, включающей всего 8 P. gingivalis -положительных образцов, с группой пациентов, состоящей из 51 положительного образца. Все эти вопросы указывают на важность разработки внутренних стандартов, позволяющих проводить действительно количественные исследования.

Эпидемиологические исследования показали, что штаммов P. gingivalis различаются по своей вирулентности: штаммы более вирулентны (например, W83, W50 и A7436, последний очень похож на W83) или менее вирулентны (например, 381, ATCC 33277) [73]. – [75]. Штамм TDC60 был выделен из тяжелого пародонтального поражения пациента и проявлял более высокую патогенность в отношении абсцессов у мышей, чем штаммы W83 и ATCC 33277 [76]. Кроме того, было показано, что существует корреляция между P.gingivalis и уровень разрушения тканей штаммом P. gingivalis W83, способствующим пародонтиту в большей степени, чем другие штаммы [77]–[79]. Поэтому в этом исследовании мы использовали анализ гена hmuY , чтобы продемонстрировать потенциальные различия в нуклеотидных последовательностях между изолятами P. gingivalis и отнести их к конкретным известным штаммам P. gingivalis . Для этого наиболее глубокие различия в нуклеотидной последовательности гена hmuY (рис.1 и рис. S2). Мы обнаружили, что в группе, состоящей из здоровых людей, наиболее распространенные изоляты обладали различиями в нуклеотидной последовательности hmuY , в основном представляющими собой комбинацию различий, встречающихся в штаммах W83/W50/A7436 (n = 4) или штаммах 381/ATCC 33277 (n = 3), по сравнению с характерной для штамма TDC60 картиной (n = 1) (рис. 1, 2 и рис. S3). В группе пациентов с хроническим пародонтитом преобладали изоляты, обладавшие нуклеотидной последовательностью hmuY , характерной для штамма TDC60 (n = 21) или комбинации штаммов W83/W50/A7436 (n = 17).У пациентов-носителей P. gingivalis картина, характерная для штаммов 381/АТСС 33277, встречалась реже (n = 13). На основании этих результатов можно предположить, что TDC60 или W83/W50/A7436 являются потенциально более вирулентными штаммами, что отражено в паттерне нуклеотидной последовательности hmuY . Основываясь на наших результатах, мы также обнаружили корреляцию между PIRI и наличием определенного изолята (штаммы TDC60, W83/W50/A7436, 381/ATCC 33277, перечисленные в соответствии с их возрастающей вирулентностью) или отсутствием P.gingivalis (r = 0,38; P  = 0,0012). Независимо от идентифицированного изолята коэффициент корреляции между наличием/отсутствием P. gingivalis и PIRI составил 0,43 ( P  = 0,0002). Все наши данные показали, что идентификация присутствия P. gingivalis на основе гена hmuY может быть связана с поздней стадией периодонтита.

Выводы

В этом исследовании мы представили обширный филогенетический анализ P.gingivalis белок HmuY и ген hmuY . Основываясь на филогенетическом анализе и исследовании образцов человека, мы продемонстрировали потенциальное использование набора праймеров на основе генов hmuY и ПЦР в реальном времени с SYBR Green для обнаружения P. gingivalis . Мы предполагаем, что область гена hmuY может служить одним из молекулярных маркеров P. gingivalis . Однако следует отметить, что дополнительные методы, например, комбинация P.gingivalis , могут потребоваться для однозначной идентификации P. gingivalis в полимикробных образцах человека. Анализ, описанный в этом исследовании, не имеет возможности для точных количественных измерений числа бактериальных клеток в полимикробных образцах. Точные количественные методы на основе ПЦР потребуют надлежащих внутренних стандартов, которые пока не разработаны.

Молекулярная идентификация видов и источников происхождения съедобных птичьих гнезд с использованием ПЦР в реальном времени на основе FINS и SYBR green I

https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2017.07.027Получить права и контент

Основные моменты

Новое понимание дифференциации EBN от домов и пещер с помощью молекулярного подхода.

ПЦР в реальном времени на основе FINS и SYBR green I использовали для идентификации EBN.

Cyt b , ND2, 12S и Fib7 были полезными генными маркерами для идентификации происхождения EBN.

FINS однозначно идентифицировал EBN по видам стрижей и происхождению продукции.

Быстрое обнаружение подлинного EBN с помощью ПЦР в реальном времени на основе SYBR green I.

Abstract

Растущий спрос и потребление съедобных птичьих гнезд (EBN) людьми во всем мире способствовали проблеме мошенничества с пищевыми продуктами. Для обеспечения подлинности EBN в отношении их происхождения очень необходимы быстрые и точные аналитические методы. В этом исследовании для определения вида и происхождения исходных и коммерческих EBN ​​был проведен криминалистически информативный метод секвенирования нуклеотидов (FINS), основанный на последовательностях митохондриальной и ядерной ДНК, а также филогенетический анализ.Цитохром b (Cyt b ), субъединица 2 НАДН-дегидрогеназы (ND2), 12S рибосомная РНК и генные маркеры интрона 7 бета-фибриногена позволили идентифицировать и классифицировать EBN, продуцируемый Aerodramus fuciphagus и Aerodramus 1 maximus 9016. . Недавно было обнаружено, что EBN из искусственных домов и естественных пещер генетически дифференцируемы с использованием митохондриальных генов Cyt b и ND2. Филогенетические результаты показали, что все образцы EBN были четко разделены на две группы по их видовому происхождению и производственному происхождению.Была разработана быстрая и экономичная альтернатива идентификации на основе ПЦР в реальном времени на основе SYBR green I, нацеленная на 177 п.н. митохондриального гена Cyt b , которая эффективно отличала настоящий EBN от подделок. Эта ПЦР в реальном времени на основе FINS и SYBR green I является высокочувствительным, специфичным и надежным методом идентификации происхождения EBN и может быть полезна для предотвращения мошеннической замены и неправильной маркировки EBN для обеспечения безопасности пищевых продуктов.

Ключевые слова

Ключевые слова

Ключевые слова

Ключевые слова

Ключевые слова

Ключевые слова

Ключевые слова

Ключевые слова

Ключевые слова

Ключевые слова

ключевые слова

Съедобные птичьего гнезда

Идентификация происхождения

15 Аэродрамус Виды

Обработно информативные нуклеотидные секвенирование (плавники)

Филогенетическое дерево

ПЦР

Рекомендуемые статьи

© 2017 Авторы.Опубликовано Elsevier Ltd.

‘Angry Birds’ está de vuelta y se convirte en el primer juego de realidad mixta for Magic Leap One

Tras convertirse en el juego más exitoso en plataformas móviles con más de 1000millones de descargas, lo que llevó a una final saturaciónque hizo que todos (o la gran mayoría) lo odiaran, ‘Angry Birds’ está de vuelta con un un juego nuevo, el cual mantiene mucho del espíritu del original de 2009, pero Ahora usando por primera vez realidad mixta.

Продавец ‘Angry Birds FPS: Рогатка от первого лица’ включает в себя приложение, созданное создателями Rovio и Resolution Games, и приложение, предназначенное для виртуальной реальности и дополненное. Lo curioso де todo esto эс дие эль juego llegará en exclusiva a Magic Leap One, el polémico dispositivo que tardó años en salir al mercado con la promesa de una revolución en el campo de la realidad virtual/aumentada.

«Angry Birds FPS: Рогатка от первого лица»

Contrario a lo que muchos pudieran pensar, ‘Angry Birds FPS’ luce bastante bien al menos en el tráiler de lanzamiento.De hecho, Rovio invitó a algunos Periodistas en Estados Unidos para que lo conocieran y jugarán antes que nadie. Los comentarios en general son positivos al mencionar Que se mantienen los elementos que dieron éxito a ‘Angry Birds’ durante varios años.

Algunos aseguran Que los graficos tiene una muy buena resolución, por lo que éste debió haber sido la demo de lanzamiento para Magic Leap One, en lugar de aquel lamentable ejemplo que le trajo tantas críticas al dispositivo.

‘Angry Birds FPS’ mantiene la mecánica de juego que todos conocemos, solo que ahora será posible movernos alrededor de los escenarios , para así analizarlos y preparar nuestra estrategia.Incluso los personajes reaccionan a nuestra presencia, por lo que tendremos risas burlonas por parte de los cerdos verdes, o mensajes de apoyo por parte de las aves enojadas.

Новый выпуск ‘Angry Birds FPS: First Person Slingshot’ был выпущен 9 октября года, но не был получен, чтобы узнать цену, де хэко, сера эль-праймер juego de la plataforma, которая находится в день рождения, но не была отмечена много вариантов на рынке. La mala noticia es que también necesitaremos un Magic Leap One, que a día de hoy solo está a la venta en Estados Unidos a un precio de 2.295 дол.

Эн Хатака | Aquí está la primera demo del dispositivo de Magic Leap… y no se parece en nada a lo que nos han querido vender desde hace años

(IF7.09), Дата публикации: 2017-11-20 , DOI: 10.1111/1755-0998.12732
А. Сентено-Куадрос, Дж. Л. Телла, М. Делиб, П. Эделаар, М. Carrete

PCR — универсальный инструмент для размножения специфических последовательностей ДНК. Например, широко используется определение пола на основе ПЦР, и доступно множество наборов праймеров. Однако этот протокол требует термоциклирования и электрофореза, поэтому результаты обычно получают в лабораториях и через несколько дней после отбора проб. Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) является альтернативой ПЦР, которая может вывести молекулярную экологию за пределы лаборатории.Хотя его применение было успешно испытано для определения пола у трех видов одного птичьего семейства (рапторы, Accipitridae), его универсальность остается непроверенной, а подходящие праймеры для разных таксонов отсутствуют. Мы разработали и испытали первый набор праймеров на основе LAMP для определения пола у современных птиц (NEO-W), основанный на фрагменте гена хромогеликаза-ДНК-связывающего белка, расположенного на специфичной для самок W-хромосоме. Поскольку ожидается, что нуклеотидная идентичность будет увеличиваться среди более родственных таксонов, таксономически ориентированные праймеры были также разработаны для отряда Falconiformes и семейств Psittacidae, Ciconiidae, Estrildidae и Icteridae в качестве примеров.NEO-W успешно определил пол у подмножества из 21 вида в 17 семействах и 10 отрядах и, следовательно, является кандидатом на пробу для всех современных птиц. Наборы праймеров, разработанные специально для выбранных таксонов, правильно определили пол оцениваемых видов. Краткое руководство по устранению неполадок для новых пользователей LAMP предназначено для выявления ложноотрицательных результатов и оптимизации реакций LAMP. Это исследование представляет собой важный следующий шаг к использованию LAMP для молекулярного определения пола у птиц и других приложений в молекулярной экологии.

Играть в игры через ANGRY BIRDS

Вчера весь интернет взбудоражил судебный процесс, связанный с Angry Birds. Художница, создавшая линию игрушек для домашних животных, по-видимому, очень зла на то, что она не получает золотые монеты от прибыльного лицензионного соглашения на торговую марку ANGRY BIRDS с Розио. Если вы не жили вне сети и если вы, возможно, немного разбираетесь в технологиях, вы, вероятно, слышали о популярной одноименной игре Rozio для планшетов, в которой разноцветные птицы швыряют предметы в ничего не подозревающих животных.

Согласно жалобе, в 2006 году Хартц обратился к художнице Джули Адамс с просьбой создать и разработать линию игрушек для домашних животных на основе ее мультяшных рисунков животных. По крайней мере, в контексте закона об авторском праве, если произведение создано в рамках служебных обязанностей или произведение является произведением, специально заказанным, и стороны договорились, что произведение является «произведением, сделанным по найму», право собственности принадлежит нанимающей стороне. . Патентное право аналогично, когда речь идет о произведениях, созданных в рамках служебных обязанностей.Но здесь у художницы и Хартц было другое соглашение, касающееся «интеллектуальной собственности» Адамс — две стороны согласились, что права остаются за ней, и Хартц передал ей лицензию на интеллектуальную собственность. В дополнение к своим правам интеллектуальной собственности на свою работу по разработке продуктов, художница также придумала торговую марку ANGRY BIRDS для своей линии согласно жалобе. На упаковке продукта есть ее биография и в общих чертах указано: «Лицензировано на основе искусства Джули Адамс». Срок действия соглашения начинался после первой продажи лицензионного продукта, говорится в жалобе.

В соответствии с «ключевыми обязанностями» Hartz по соглашению о продлении и защите интеллектуальной собственности Adams, Hartz подала заявку на регистрацию товарного знака ANGRY BIRDS для игрушек для домашних животных. Заявление о намерении использовать было подано Hartz 28 марта 2007 г., в котором Hartz указан как владелец интеллектуальной собственности, в отличие от очевидных условий соглашения, описанных в жалобе.

Подписывая заявку на регистрацию товарного знака, подписывающая сторона подтверждает, что «заявитель заявляет, что у него есть добросовестное намерение использовать или использовать через связанную с заявителем компанию или лицензиата знак в торговле на или в связи с указанными товарами и/или услугами.   Кроме того, подписывающее лицо заявляет, что:  «он/она считает, что заявитель является владельцем товарного знака/знака обслуживания, регистрация которого испрашивается, или, если заявка подается в соответствии с 15 U.S.C. Раздел 1051(b), он/она считает, что заявитель имеет право использовать такой знак в коммерческих целях; Насколько ему/ей известно и насколько он/она считает, никакое другое лицо, фирма, корпорация или ассоциация не имеет права использовать знак в торговле либо в его идентичной форме, либо в таком близком сходстве с ним, которое представляется вероятным, при использовании на или в связи с товарами/услугами такого другого лица, чтобы вызвать путаницу, или вызвать ошибку, или ввести в заблуждение.Подписантом здесь был поверенный Харца, который подтвердил права, интересы и право собственности Харца на товарный знак, подписав документ. Это заявление, вероятно, должно было быть подано на имя Адамс как владельца прав на интеллектуальную собственность, если это была интеллектуальная собственность, согласно соглашению, принадлежащая ей и предоставленная Харту по лицензии.

Похоже, что еще не все факты известны, так как жалоба оставляет много вопросов без ответа, особенно в отношении объема ее прав на интеллектуальную собственность.Например, и, что немаловажно, через несколько месяцев после того, как была подана заявка на ANGRY BIRDS, была подписана поправка к лицензионному соглашению, которая предоставила Hartz «право подавать документы об авторских правах, товарных знаках и других правах интеллектуальной собственности от имени Hartz по своему усмотрению для всех Лицензионных продуктов», включая знак THE JULI ADAMS COLLECTION (заявка на которую была подана Hartz одновременно с ANGRY BIRDS). В жалобе оспаривается действительность этой поправки.

Что это означает для маркетологов, разработчиков продуктов, рекламодателей и других лиц, создающих интеллектуальную собственность? Один из выводов может заключаться в том, чтобы уделить больше внимания составлению хорошо составленного соглашения, которое отвечает вашим целям и вашему пониманию ваших прав. Даже если намерение состоит в том, чтобы лицензировать вашу интеллектуальную собственность, владелец товарных знаков ставит себя в наилучшее положение, даже если они не хотят нести ответственность за подачу заявок в будущем, подавая заявки от своего имени и позволяя лицензиату согласиться оплатить все сборы, связанные с ними.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.