Перевязка фбс блоков: Перевязка фбс блоков снип

Содержание

Перевязка фбс блоков снип

Широким распространением в последние годы начали пользоваться сборные ленточные фундаменты из блоков ФБС (аббревиатура ФБС – фундаментные блоки стен). Запас прочности таких фундаментов позволяет выдерживать на себе и пяти-, и десятиэтажные сооружения, поэтому постройка двухэтажного кирпичного коттеджа на его основании не вызовет никаких проблем.

Сборные фундаменты из блоков ФБС могут закладываться в следующих случаях:

Помимо этого, весомым преимуществом является экономичность монтажа: фундамент из блоков ФБС при одинаковой глубине заложения обойдется дешевле, чем монолитный. Можно сэкономить на фундаменте и больше, если:

— Использовать б/у блоки ФБС — Возвести сборный прерывистый фундамент

Блоки ФБС выпускаются нескольких типоразмеров: длиной 780, 1180 и 2380 мм; шириной 300, 400, 500 и 600 мм. Высота всех типов блогов составляет 580 мм. На боковых гранях блогов имеются специальные пазы, заполняемые раствором в процессе монтажа.

Первый ряд блоков ФБС нужно поставить на выравнивающее основание из крупнозернистого песка толщиной 10-15 см. Для этого из брусков 50*100 мм изготовляется рамка шириной на 20 см больше, чем ширина подошвы фундамента. По нивелиру рамка устанавливается горизонтально и заполняется песком. Песок смачивается и трамбуется; все излишки удаляются с помощью любой ровной рейки.

Вначале устанавливаются угловые блоки наружных стен

Для этого на песке проводятся линии, по которым нужно установить блоки. Блок встанет строго по уровню, если основание насыпано качественно. Можно осуществить монтаж даже вдвоем, используя шесть несложных команд (груз вверх – груз вниз, стрела вверх – стрела вниз, стрела вправо – стрела влево).

Сначала выкладываются наружные стены, затем внутренние. Вертикальные швы тщательно забиваются раствором. На место доборного блока лучше залить монолитную плиту (установка целого блока – довольно трудоемкая задача).

Каждый следующий ряд блоков выкладывается на растворную постель толщиной не менее 1,5 см.

Перевязка вертикальных швов должна быть 25-60 см. Возможная перевязка будет тем меньше, чем лучше свойства грунта на строительной площадке. Если в каком-либо месте требование по перевязке невыполнимо, то на данном участке фундамента необходимо заложить несколько кусков арматуры диаметром 8-10 мм, либо кладочную сетку. Важно не забыть оставить в фундаменте отверстия под ввод воды и вывод канализации.

Блоки длиной 2380 мм. имеют основной приоритет при возведении ленточного сборного фундамента, так как чем меньше вертикальных швов будет в фундаменте, тем выше будет его прочность, тем скорее осуществиться постройка и тем меньше будут расходы на его монтаж.

Поскольку прочность материала блоков ФБС больше прочности кирпича, ширина стен, возводимых на такой фундамент, может быть больше ширины самого сборного фундамента. Однако нужно учесть, что свес кирпичной кладки ограничен: при свесе с одной стороны – не более 10 см; при свесе с обеих сторон – не более 6 см на одну сторону.

В случае слабых грунтов необходимо увеличить ширину основания сборного фундамента.

В такой ситуации имеется две альтернативы:

  • Выложить первый ряд из фундаментных блоков-подушек
  • Залить под фундамент из блоков ФБС монолитную бетонную плиту

Если дом строится без подвала и на грунте, обладающем хорошей несущей способностью, то можно возвести прерывистый сборный фундамент. В этом случае блоки ФБС укладываются с промежутками, которые затем заполняются грунтом с послойным трамбованием. Такая методика позволяет сэкономить до 20 % блоков.

Промежутки между блоками ФБС при возведении сборного прерывистого фундамента не должны превышать 70 см. Использование такого фундамента допускается только для домов не более 2-х этажей из облегченной кладки (например, пустотелого кирпича).

Перед возведением подобного типа фундамента стоит обратиться к профессиональным инженерам и архитекторам.

Увеличение прочности фундамента на слабых грунтах может быть осуществлено посредством установления по верхнему ряду блоков железобетонного пояса толщиной 20-30 см, каркас которого вяжется из четырех прутков диаметром 10 мм.

Для обеспечения пространственной жесткости сборного фундамента предусматривается связь между продольными и поперечными стенами путем перевязки их фундаментными стеновыми блоками или закладки в горизонтальные швы арматурных сеток.

Фундаментные стеновые блоки укладывают с перевязкой вертикальных швов на участке длиной не менее высоты фундаментного стенового блока на структурно неустойчивых грунтах и не менее 0,4 высоты блока при модуле деформации грунтов E> 10 МПа.

Ф.9.18. Какую конструкцию имеют столбчатые фундаменты под стены?

Столбчатые фундаменты (см.рис.Ф.9.12,з,к) применяются в зданиях с конструктивной схемой из неполного каркаса. Столбчатые фундаменты состоят из фундамента стаканного типа, на обрез которого укладываются фундаментная балка или цокольная панель. Фундаменты данного типа допускается устраивать на грунтах с высокими деформационными и прочностными характеристиками. Это объясняется тем, что подобные фундаменты не допускают неравномерности деформаций. Фундаменты армируются в плоскости подошвы сварными сетками и пространственными каркасами в теле столба (колонны).

Ф.9.19. Какую конструкцию имеют отдельно стоящие фундаменты под колонны?

Отдельно стоящие фундаменты (см.рис.Ф.9.12,л,м) устраивают под колонны из монолитного железобетона, включая плитную часть ступенчатой формы и подколонник. Монолитные фундаменты выполняются как одно целое с колоннами. При этом арматура колонн соединяется с арматурой фундамента (рис.Ф.9.19). Сопряжение сборных колонн с фундаментом осуществляется с помощью стакана, а металлических колонн при помощи анкерных болтов.

Рис.Ф.9.19. Соединение колонн с фундаментом: а — монолитное; б — со стальной колонной; 1 — арматура; 2 — анкерные болты

Высота ступеней принимается кратной 150 мм. Первая ступень должна быть не менее 300 мм. Ширина ступеней определяется из условия продавливания.

В песчаных грунтах под монолитными фундаментами обязательно устраивается монолитная подготовка толщиной 150 мм из бетона марки не ниже М. 50. В глинистых грунтах подготовку можно не устраивать, но необходимо увеличить защитный слой бетона до 80 мм.

Отдельные фундаменты могут быть сборными, состоящими из одного или нескольких элементов (см.рис.9.12,м).

Ф.9.20. Какую конструкцию имеют щелевые фундаменты?

Щелевые фундаменты (рис.Ф.9.20) представляют собой тонкие стенки толщиной от 10 до 20 см, устраиваемые путем прорезки грунта и заполнения щели бетоном с полным или частичным армированием. Подколонник опирается непосредственно на бетонные пластины и выполняется в монолитном варианте. Преимущество щелевого фундамента в том, что нагрузка на основание передается не только торцом, но и боковой поверхностью. Однако щелевые фундаменты можно устраивать только в глинистых грунтах.

Рис.Ф.9.20. Ленточный многощелевой фундамент: 1 — поверхность грунта; 2 — распределительная плита; 3 — надземная стена; 4 — бетонные пластины; 5 — перекрытие; 6 — пол подвала

При разработке щели барой часть грунта остается на ее дне и зачистку приходится делать вручную, что снижает технологичность устройства подобных фундаментов.

Ф.9.21. Какую конструкцию имеют фундаменты, устраиваемые в вытрамбованных котлованах?

Фундаменты в вытрамбованных котлованах (рис.Ф.9.21) устраивают с помощью конической или трапецеидальной трамбовки путем ее сбрасывания с высоты 4-6 м до образования полости в грунте, которая заполняется бетоном. Преимущество подобного фундамента в том, что при вытрамбовании грунта вокруг котлована образуется зона с большей плотностью, чем плотность естественного грунта. В результате не только увеличивается несущая способность фундамента, но и частично устраняются просадочные свойства лессовых грунтов.

Рис.Ф.9.21. Фундаменты в вытрамбованных котлованах: а — столбчатый без уширения; б — с уширенным основанием: 1 — стакан для установки колонны; 2 — фундамент; 3 — уплотненная зона грунта; 4 — втрамбованный жесткий материал (грунт)

Несущую способность фундамента можно увеличить, если выполнить устройство уширенной зоны втрамбованием в грунт щебня.

Применение фундаментов в вытрамбованных котлованах дает наибольший эффект при степени влажности

Sr0,75 и удельном весе не более 16 кН/м3.

Перевязка блоков фбс: поэтапное выполнение работ


Это фундаментные стеновые блоки. Второе предназначение – возведение стен подвальных помещений. Из блоков создают конструкции, имеющие различное предназначение и эксплуатирующиеся при частых температурных перепадах от минус семидесяти до плюс пятидесяти градусов. Показатель прочности таких фундаментных сооружений выдержит нагрузку в пять – десять этажей, так что возвести на таком фундаменте двухэтажный объект можно без особых проблем. Только необходимо разобраться, как выполняется перевязка блоков фбс.

С чего начать?

Бетонные блоки фбс используются для обустройства фундаментов в районах с разными климатическими условиями и по любым типам почвенного состава.

Как правило, все работы начинаются с выполнения замеров и разбивки осей будущей фундаментной основы. Для удобства проведения работ натягиваются по осевым точкам шнуры, отвесами переносятся места их пересечений на дне котлована.

От полученных результатов отмеряются размеры фундаментного основания по проектному решению, фиксируются металлическими штырями таким образом, чтобы шнуровая причалка располагалась на удалении двух – трех миллиметров от боковых стен фундаментной основы.

Блоки ФБС и их разновидности

Для обозначения сборного ленточного фундамента из бетонных блоков принята аббревиатура ФБС. Она получена от словосочетания «фундаментный блок стеновой». Их главное назначение – скоростное возведение ленточных фундаментов для зданий разного типа.


Они могут использоваться и для строительства столбчатых фундаментов. В этом случае они устанавливаются в вертикальном положении.

Фундаментные ФБС производятся по требованиям, изложенным в ГОСТ 13579-78 «Блоки бетонные для стен подвалов».

При изготовлении используются такие материалы:

  1. Тяжелый армированный бетон марок от М-100 (В-7,5) до М-200 (В-15), имеющий плотность более 1800 кг/куб. м.
  2. Цемент белого или серого цвета, разновидности портландцемент, марки М500 или М400.
  3. Щебень, может использоваться гравий, крупность от 5 до 20 мм, насыпная плотность не более 800 кг/куб. м.
  4. Арматурная сталь прочная или высокой прочности, классов:
  • А I (вариант обозначения – А-1) – арматура гладкая, марки стали – Ст3сп, Ст3кп, Ст3пс;
  • А III (А-3) профиль периодический (один поперечный выступ (под углом) и два продольных, марки стали 32Г2Рпс, 35ГС, 25Г2С;
  • Вр-1 – холоднотянутая проволока из стали по ГОСТ 6727–80, с диаметрами от 5 до 3 мм, низкоуглеродистая;
  • Вр-2 – для предварительно напряженного армирования ФБС.
  • Бетон используется таких разновидностей:
  • «П» – пористый или керамзитобетонный;
  • «Т» – тяжелый, с объемной плотностью не менее 1800 кг/куб. м;
  • «С» – силикатный плотный.

Форма ФБС – прямоугольный параллелепипед. В верхней его части имеются проволочные петли для строповки. После раскладки, установки и монтажа фундаментных блоков эти петли загибаются кувалдой.

Габариты: длина ФБС от 880 до 2400 мм, ширина от 300 до 600 мм, высота – 580 или 280 мм. По индивидуальному заказу на заводе могут изготовить ФБС большей длины. Меньших габаритов называют «доборными». Они позволяют дополнить недостающую длину фундамента.

ФБС блоки по конструкции бывают:

  • ФБС – сплошные по всей длине;
  • ФБВ – имеющие вырез для пропускания коммуникаций под потолком;
  • ФБП – пустотелые, открытые снизу для уменьшения веса.

Блоки своими руками профессиональные строители изготавливать не рекомендуют.

Устройство сборных фундаментных основ

Такое основание может возводиться в определенных случаях:

  • если сроки проведения строительных работ сокращены по времени. Блочный фундамент можно выложить за несколько дней и сразу начать строительство стен;
  • использование работников с низким квалификационным уровнем. При обустройстве такого основания отпадает необходимость в вязке арматурного каркаса.

Стоит отметить и экономическую сторону вопроса – блочный фундамент при одинаковой заглубленности обойдется значительно дешевле монолитного аналога.

Есть возможность сэкономить на устройстве основания еще больше, воспользовавшись блоками, бывшими в употреблении, или возводя прерывистую фундаментную основу.

Блочный материал выпускается по нескольким типовым размерам:

параметры сторонгабариты, см
длина78; 118; 238
ширина30; 40; 50; 60
высота58 для всех типов материала

Боковые стороны имеют пазы, заполняющиеся растворной массой при выполнении монтажных работ.

Первый блочный ряд выставляется на ровное основание с подушкой из крупнофракционного песка, толщина которой составляет десять – пятнадцать сантиметров. Ведение кладки начинается с угловых участков наружной стены. С этой целью проводят линию, по которой необходимо устанавливать блоки. Если основа сделана качественно, то камни устанавливаются по одному уровню. Монтажные работы можно выполнять в паре, применяя несложное подъемное устройство.

В первую очередь выкладывают наружную стенку, потом переходят к внутренним. Вертикальные шовные участки тщательно заполняются растворной массой. На места, предназначенные для доборных элементов, рекомендуется заливать плиты монолитного типа.

Перед выкладкой очередного ряда устраивается растворный шов, толщина которого составляет минимум полтора сантиметра.

Вертикальную перевязку фундаментных блоков выполняют в 250 – 600 мм. Она т тем меньше, чем качественней грунт на стройплощадке. Если есть участки, в которых перевязочные требования выполнить не представляется возможным, то рекомендуется в таких местах закладывать отрезки арматурных прутьев, диаметр которых равен восьми – десяти миллиметрам, либо монтировать сеточку для кладочных работ.

Не забудьте, что в фундаментной основе следует оставить отверстия для отвода воды и канализационный выход.

Блочный материал, длина которого составляет 238 см, обладает преимуществом при обустройстве ленточной фундаментной основы, потому что чем меньшее количество швов получится, тем выше окажется показатель его прочности, быстрее закончится процесс строительства, и минимизируются финансовые затраты на проведение монтажных работ.

Так как прочность блоков фбс значительно выше, чем у кирпичного материала, ширина стены, устраиваемой по такому основанию, может быть по величине больше самой основы. При этом необходимо учитывать, что свес кирпичной кладки ограничивается – до десяти сантиметров на одну сторону, и не более шести – на две.

Если строительство ведется на слабоватых грунтах, ширину основы фундамента необходимо увеличивать. Есть два альтернативных способа:

  • первый ряд выкладывается из блоков – подушек;
  • под фундаментные блоки заливается монолит.

Когда строящийся дом не имеет подвального помещения и возводится на почве с отличными несущими возможностями, то обустраивается сборная фундаментная основа прерывистого типа. В таком случае блочный материал выкладывается с промежутком, пустотные участки засыпаются грунтом послойно, тщательно трамбуются. Данный метод дает возможность экономить до двадцати процентов блочных камней.

При устройстве такой перевязки фундаментных блоков, промежутки не должны превышать семидесяти сантиметров. Применяется такой фундамент для двухэтажных объектов, в которых стены возводятся из легких материалов.

Для обустройства такой фундаментной основы рекомендуется проконсультироваться у профессиональных инженеров.

Увеличить прочность фундамента на слабом грунте можно за счет установки на верхнем ряду ж/б пояса, толщина которого составит от двадцати до тридцати сантиметров. Каркас для такого пояса готовится из десятимиллиметровых арматурных прутьев.

Чтобы обеспечить пространственную жесткость сборной фундаментной основы, предусматривают связь продольных и поперечных стен перевязкой их блоками фбс либо закладкой арматурной сеточки по горизонтальным швам.

Блоки выкладываются с перевязкой вертикального шва по участку, равному высоте блока фбс на слабоустойчивых грунтах. Если грунт имеет деформационный модуль более 10 МПа, то значение должно быть не менее четверти высоты блочного камня.

Что собой представляет, фото

Для строительства столбчатого основания под дом (сарай, террасу, веранду) на собственном участке чаще всего используются блоки ФБС размером 20х20х40, так как они:

  • прочные — выдерживают нагрузки 150 кг на квадратный сантиметр;
  • морозоустойчивы — переносят 15 и более циклов заморозки;
  • примерная масса одного блока — 32 кг, потому специальная техника при возведении не потребуется.

До начала возведения фундамента необходимо выяснить, какой тип грунта находится в месте строительства и глубину его промерзания, уровень залегания грунтовых вод, а также наличие «водяных линз», которых быть не должно. Грунтовые воды не должны проходить ближе, чем в 50 см от подошвы столбов.

От глубины промерзания зависит, насколько глубоко потребуется заложить опору под сооружение

Для пристроек (терраса, веранда) строится отдельный фундамент, который затем не связывается в одну конструкцию при помощи ростверка. Так делается, потому что нагрузка на опору таких сооружений другая — она меньше. Столбы под печь ставятся отдельно от общей системы фундаментов.

Конструкция столбчатого фундаментного основания для стен

Такое основание используют в сооружениях, конструктивная схема которых состоит из неполного каркасного элемента. Столбчатый фундамент состоит из фундаментной основы стаканного вида, по обрезу которой выкладывается балка либо панель цокольного этажа.

Такие фундаменты разрешается устанавливать на почвенных составах с хорошими деформационными характеристиками и показателем прочности. Объясняется это тем, что такой фундамент не допустит неравномерное деформирование. Армирование фундамента выполняется в подошве сварной сеточкой и каркасом в самом столбе.

Конструкция фундаментной основы под колонну

Отдельно расположенный фундамент устраивается под колонну из монолитной ж/б плиты. Он выполняется как единое целое с колонной. Арматуру колонны соединяют с прутьями фундаментной основы, сопряжение колонны с фундаментной частью выполняется при помощи стакана.

По песчаному составу почвы под монолитной фундаментной основой в обязательном порядке устраивают монолитную подготовку, толщина которой достигает полутора сантиметров. Бетонный состав используется марки м50. На глинистых участках подготовку разрешается не выполнять, но защитный бетонный слой увеличивается до восьми сантиметров.

Устройство щелевой фундаментной основы

Они представлены тонковатыми стенами от десяти до двадцати сантиметров. Их делают прорезкой грунта и наполнения щелевых участков бетонным раствором, выполняя армирование.

Подколонник в таком случае опирается сразу на пластину бетона, исполненную монолитным способом. Достоинство такой фундаментной основы состоит в том, что нагрузочное воздействие подается не только торцевыми участками, но и боковинами блоков. Такие конструкции разрешается возводить исключительно по глинистым участкам.

Неудобство заключается в том, что во время устройства щели часть почвы остается на месте, и зачистка выполняется вручную. От этого технологичность возведения таких оснований снижается.

Если нужно установить основание в вытрамбованном котловане, то используют коническую или трапецеидальную трамбовку, которую сбрасывают с пятиметровой высоты, пока в почве не образуется полость, которую потом заполняют бетонным раствором.

Достоинство способа заключается в образовании участка с повышенной плотностью. Это увеличивает несущие возможности фундаментного основания, частично устраняет просадку грунта.

Плитный фундамент для здания из газобетона

Такое решение для сложных грунтовых условий становится всё более популярным среди застройщиков. Его эффективность доказана опытом зарубежного строительства, например, на крайне слабых и исключительно влажных грунтах Голландии. Аналогичные условия встречаются на Северо-Западе России и в некоторых иных регионах.

Заливка плитного фундамента.

Основание под стены имеет вид армированной в два слоя железобетонной плиты высотой от 20 до 40 миллиметров. Она может заливаться на уровне поверхности или быть заглублённой до глубины промерзания или ниже, что позволяет устраивать в здании подвального помещения. Возникающие изгибающие нагрузки перераспределяются в массиве плиты благодаря совместной работе на растяжение арматуры и бетона на сжатие. Это обеспечивает необходимую жёсткость и неизменность геометрических характеристик поверхности плиты, на которой и возводятся все конструкции здания.

Плитный фундамент с не разобранной опалубкой.

При устройстве плитного фундамента на уровне проектной отметки рельефа, под ней производится замена естественного грунта на тщательно утрамбованный насыпной материал с высокими показателями по несущей способности. Дно выборки может быть выше нормативной глубины промерзания в регионе.

Монтаж сборного ленточного фундамента из блоков ФБС

Монтаж сборного ленточного фундамента из блоков ФБС.

Для кирпичных домов с подвалом сборный ленточный фундамент является одним из лучших вариантов по надежности и скорости монтажа. Кроме того для индивидуальных застройщиков есть возможность сэкономить используя б/у блоки ФБС. Основным принципом является заложение фундамента ниже отметки промерзания грунта. Ширина подошвы для каждого случая индивидуальна и зависит от веса здания и несущей способности грунтов. Ниже описана пошаговая инструкция монтажа фундамента из блоков ФБС. Монтаж сборного ленточного фундамента из бетонных блоков ФБС необходимо выполнять с учетом требований СП 70.13330.2012 «Несущие и ограждающие конструкции» Актуализированная редакция СНиП 3.03.01-87 Индивидуальные застройщики могут воспользоваться типовыми решениями серии 2.110-1 «Детали фундаментов жилых зданий» выпуск 1, выпуск 4. В настоящее время данная серия официально не действует, но по ней было построено множество домов. Для информации здесь размеры, вес и маркировка блоков Работы по монтажу фундамента здания относятся к скрытым работам и должны быть зафиксированы актами освидетельствования скрытых работ.

Разработка котлована.

1. Случайные переборы грунта при разработке котлована или траншеи в отдельных местах должны быть заполнены тем же грунтом, доведенным до естественной плотности. 2. Для того что бы грунт основания не размывало, размягчая и снижая его несущую способность, до устройства фундаментов должны быть выполнены работы по отводу поверхностных и подземных вод от котлована (открытый водоотлив или дренаж, водопонижение и др.). 3. Перерыв между окончанием разработки котлована и устройством фундамента, как правило, не допускается. При вынужденных перерывах должны быть приняты меры к сохранению природных свойств грунта основания.

1. Укладка фундаментных блоков на промороженное, покрытое льдом, снегом или водой основание запрещается. 2. Фундаментные блоки укладывают на тщательно выровненное песчаное основание или песчано-цементную подушку толщиной не менее 5 см (на глинистых грунтах основания). Отклонение отметки выравнивающего слоя песка от проектной не должно превышать -15 мм. 3. Установку блоков начинают с установки маячных блоков в углах здания и на пересечении осей. Маячные блоки устанавливают, совмещая их осевые риски с рисками разбивочных осей, по двум взаимно перпендикулярным направлениям. К установке рядовых блоков следует приступать после выверки положения маячных блоков в плане и по высоте. 4. Кладку фундаментных блоков выполняют на цементном растворе не ниже М-50. Горизонтальные и вертикальные швы между блоками заполняют раствором на всю толщину стены и высоту шва. Толщина швов не более 20мм.

5. Установку блоков стен подвала следует выполнять с соблюдением перевязки (серия 2.110-1 «Детали фундаментов жилых зданий» выпуск 1 деталь 19). Для индивидуальных жилых домов высотой до трех этажей необходимая величина перевязки блоков не менее 240мм. Для определения необходимого количества блоков ФБС нужно сделать развертку каждой стены на которой нарисовать блоки с учетом их размеров и соблюдения перевязки.

Пример чертежа раскладки ФБС.

6. Для увеличения прочности конструкции в местах пересечения стен необходимо уложить арматурные сетки.

Если дверной проем в подвале примыкает к одной из стен длина арматурной сетки определяется по рисунку ниже (серия 2.110-1 «Детали фундаментов жилых зданий» выпуск 1 деталь 20.

Схемы раскладки арматурных сеток.

Размеры арматурных сеток для изготовления.

Спецификация металла на сетки.

7. Рядовые блоки следует устанавливать, ориентируя низ по обрезу блоков нижнего ряда, верх — по разбивочной оси. Блоки наружных стен, устанавливаемые ниже уровня грунта, необходимо выравнивать по внутренней стороне стены, а выше — по наружной. Вертикальные и горизонтальные швы между блоками должны быть заполнены раствором и расшиты с двух сторон. 8. Монолитные участки в стеновых блоках соприкасающиеся с грунтом (ниже поверхности земли), выполнять из бетона В 7.5 или из кирпича КОРПо 1НФ/100/2,0/35/ГОСТ 530-2007 с последующей штукатуркой снаружи цементным раствором марки 50 и обмазкой горячим битумом за 2 раза. 9. Участки стен подвала выше уровня земли не соприкасающиеся с грунтом заделывать кладкой из кирпича КОРПо 1НФ/100/2,0/35/ГОСТ 530-2007 на растворе М 75. 10. В стенах подвала над проемами шириной не более 600 мм укладываются фундаментные блоки (серия 2.110-1 выпуск 4 деталь 8, 12) или монолитный бетон кл. В 10 армированный арматурой А- I диаметром 10 мм из расчета 1 стержень на 120 мм толщины стены с опиранием по 250 мм (серия 2.110-1 выпуск 4 деталь 9). Над проемами шириной более 600 мм укладывать перемычки (серия 2.110-1 выпуск 4 деталь 11.

11. После завершения монтажа трубопроводов инженерных коммуникаций все оставленные для них отверстия в наружных и внутренних стенах заделать бетоном кл. В 7,5 с обеспечением герметичности вводов коммуникаций.

Гидроизоляция стен фундамента.

Защита стен от попадания капиллярной влаги достигается устройством горизонтальной оклеечной гидроизоляции в уровне выше отмостки, обмазочной гидроизоляции вертикальных поверхностей стен подвала (технического подполья), соприкасающихся с грунтом и укладкой жирного цементно-песчаного раствора в уровне подготовки под полы подвала (технического подполья). Горизонтальную гидроизоляцию из 2 слоев гидроизола на битумной мастике по выровненной поверхности выполнять по всему периметру наружных и внутренних стен на отметке выше отмостки (и выше тающего весной снега). Горизонтальную гидроизоляцию из слоя жирного цементного раствора состава 1:2 и толщиной 20 мм выполнять в уровне ниже пола подвала. Вертикальную гидроизоляцию стен подвала, крылец, входов в подвал соприкасающихся с грунтом выполнить обмазкой горячим битумом за 2 раза.

Засыпка пазух фундамента.

Обратную засыпку пазух непучинистым грунтом с тщательным послойным трамбованием производить после устройства цокольного перекрытия, выполнения кирпичной кладки всех стен до уровня низа окон первого этажа и засыпки грунта внутри здания до проектной отметки.

Контроль качества работ.

Величина параметра, см.

Навигация по записям

Монтаж фундамента из блоков ФБС

Краткое описание

Одной из разновидностей строительных работ по возведению фундаментов является монтаж фундамента из блоков ФБС. Несмотря на то, что во многих европейских странах отказались от сборных фундаментов, в России они по-прежнему популярны и широко применяются для построек любого типа. Данный фундамент имеет большой запас прочности и с легкостью выдержит коттедж или частный дом.

Фундамент из блоков ФБС возводится за несколько дней без предварительной подготовки. Причем сделать это может человек, не обладающий специальными навыками и опытом строительства.

Фундамент из блоков ФБС можно сделать за пару дней, что делает строительство из них предпочтительным тогда, когда нет времени на монтаж монолитных конструкций. Конструкциям из блоков ФБС не требуется времени для набора прочности, строительство стен может быть начато сразу после их возведения. Сложить такой фундамент несложно, с этим можно справиться и своими силами, даже при отсутствии опыта и специальных знаний. При этом не нужен монтаж опалубки и выполнение армирования.

Что касается финансов, то монтаж фундамента из ФБС является более экономным, чем все остальные виды подобных построек. Сделать расчет количества необходимых стройматериалов несложно. Хоть кубометр блоков и будет стоить немного дороже кубометра бетона, вы сэкономите на возведении опалубки и вязании арматуры. Земляные работы и в том, и в другом случае будет одинаковыми, поэтому они не берутся в расчет. Если вы решите построить прерывистый фундамент, или использовать в строительстве бывшие в употреблении блоки, экономия будет еще более значительной.

Фундаментные блоки ФБС имеют различные размеры. Выбор того или иного виды блоков зависит от габаритов будущего здания.

Блоки ФБС могут иметь различные размеры – длину от 780 до 2380 мм и ширину от 300 до 600 мм, однако высота у всех одинаковая – 580 мм. В боковых частях блоков имеются пазы, забиваемые при монтаже бетонным раствором. Монтаж фундамента лучше всего осуществлять с использованием блоков, имеющих длину 2300 мм, строительство фундаментов из этих блоков предполагает меньшее количество вертикальных швов и большую прочность конструкции. Кроме того, сделать фундамент из таких блоков гораздо проще и быстрее, а затраты на услуги рабочих и крана в таком случае минимальны.

Монтаж ФБС

Перед тем, как сделать укладку блоков, делают выравнивающее основание из крупнозерного песка.

Оно должно иметь толщину не меньше 10 см. Для большего удобства, внутри котлована делают рамку из деревянных брусков шириной на 20 см большей, чем ширина подошвы фундамента. Рамку следует выровнять по горизонту при помощи лазерного уровня, после чего заполнить ее песком, смочив и утрамбовав его. Излишки песка необходимо удалить с помощью ровной планки. Не стоит забывать и о гидроизоляции фундамента, тем более, если вы планируете строить дом с подвалом.

Структура ленточного фундамента из блоков ФБС.

В первую очередь должны укладываться угловые блоки для внешних стен будущего дома. Когда они будут уложены, по песку проводится линия, по которой в дальнейшем будут укладываться все остальные блоки. Если монтаж основания был выполнен правильно, то блок встанет идеально. При укладке блоков вам придется давать крановщику команды, поэтому, если у вас нет опыта работы с краном, заранее договоритесь с крановщиком о знаках команд. Укладывать блоки лучше всего вдвоем. Первым делом необходимо построить все наружные стены, после чего можно приступать к укладке внутренних. Все вертикальные швы нужно тщательно забить бетонным раствором. Доборный блок сложно сделать из целых блоков, поэтому лучше выполнить монолитную вставку.

Последующие ряды укладываются на раствор, имеющий толщину около полутора сантиметров. Перевязка вертикальных швов будет составлять 25-60 см, она напрямую зависит от грунта. Чем выше свойства грунта, тем меньше она будет. Если данные рекомендации по перевязке выполнить невозможно, нужно будет заложить кладочную сетку. При строительстве фундамента нужно делать отверстия для подвода воды к дому и отвода канализации.

Благодаря тому, что ФБС блоки делают в заводских условиях, соблюдая все технологические нормы и требования, они обладают высокой прочностью. Однако свисание с фундамента кирпичной кладки все же ограничено до 6 см, если его делают на обе стороны, и до 10 см – если на одну.

Схема здания, фундамент которого выполнен из блоков ФБС.

Если участок, на котором будет строиться дом, имеет слабый грунт, ширину основания под фундамент нужно увеличить. Для это необходимо делать ряд из специальных подушек, расстояние между которыми не должно превышать 70 см. При укладке первого ряда блоков, под всеми вертикальными швами необходим расположить блоки-подушки. Промежутки между ними следует засыпать грунтом и утрамбовать. Если грунт имеет плохую несущую способность, для придания фундаменту наибольшей прочности, поверх блоков заливают монолитный пояс толщиной 20-30 см. Его каркас обычно делают с использованием четырех ниток арматуры диаметром 1 см.

Если грунты на месте постройки имеет достаточно хорошие несущие способности, а дом не будет иметь подвала, возможен монтаж фундамента с прерывистой укладкой блоков. При этом ФБС блоки будут укладываться не сплошными рядами, а с некотором промежутком между ними. Такой способ строительства позволяет уменьшить расход блоков и сократить финансовые затраты. Промежутки должны быть засыпаны грунтом и утрамбованы. Вертикальные швы должны находиться строго над предыдущим блоком. В общем, монтаж прерывистого блочного фундамента должен предполагать специальный предварительный расчет, который зависит от проекта здания. Однако в любом случае расстояние между его элементами не должно быть более 50 см. Кроме того, такие конструкции не следует делать при постройке дома, имеющего более двух этажей, и но и для домов с малой этажностью нужно сделать облегченную кирпичную кладку.

Подготовка основания

Первым этапом работ по возведению фундамента будет разбивка осей. Ее начинают с перестановки осей фундамента на дно траншеи, приготовленное заранее. Для этого натягиваются осевые нити, после чего при помощи обвесов или лазерных инструментов точки пересечения переносятся на дно котлована. Они будут служить отправными при измерении проектных размеров фундамента. Их необходим закрепить металлическими штырями или обрезанной арматурой так, что бы шнур-причалка выступал на 0,2 см дальше, чем внешняя грань блочного фундамента.

Основание под фундамент чаще всего изготавливается из песка, который уплотняется и выравнивается. Если грунт является песчаным, ФБС блоки можно монтировать прямо на выровненное основание, при остальных видах грунта применяется песчаная подготовка. Ее толщина обычно составляет 5-10 см. Под песчаным основание не должно быть рыхлого и неуплотненного грунта. Длина и ширина основания должны быть больше фактических размеров фундамента на 20-30 см.

Основные этапы

Для того чтобы осуществить монтаж блочного фундамента, вам понадобятся следующие инструменты и материалы:

  • блоки, желательно с готовым отверстиями;
  • песок;
  • цемент или бетонная смесь;
  • лопата;
  • лазерный уровень;
  • арматурная сетка;
  • веревка;
  • гидроизоляционный материал;
  • строительный кран;
  • бетономешалка.

Перед поднятием первого блока, убедитесь в том, что опоры крана находятся находятся на достаточном расстоянии от края котлована или траншеи во избежание сползания грунта или осыпания краев котлована. Не допускается монтаж на покрытую водой или снегом поверхность. В первую очередь делают установку блоков-маяков, располагающихся в углах и на пересечениях и перемычек. От их правильной установки зависит соответствие проектных размеров фундамента фактическим. После чего причалка должна постепенно переноситься вверх с увеличением рядов выложенных блоков. Небольшие отклонения в размерах относительно причалки можно скорректировать, передвигая элементы кладки ломом.

Правильное расположение и соответствие блоков проверяется при помощи нивелира. Если деталь конструкции уложена с превышающим допустимые значения отклонением, ее нужно достать краном, примерить заново и вновь уложить в фундамент. Монтаж блоков осуществляется по схеме, подобной кирпичной кладке с чередованием рядов через 1-2 и перевязкой швов вразбежку. Блоки кладутся на цементный раствор, высота кладки может составлять до 5 штук.

В случае, если проектные размеры стены не кратны длине фундаментных блоков, промежутки, которые образуются между ними заполняют специальными доборными элементами, так называемыми пломбами, монолитными железобетонными вкладками. Допускается наличие незначительных зазоров между элементами фундамента для проведения в дом подземных коммуникаций – водоснабжения, канализации и электрики. Все швы должны полностью заполниться раствором.

Строительство фундамента из блоков ФБС своими руками

Строительство фундамента из блоков ФБС

Содержание статьи:

Как известно от прочного фундамента зависит судьба и долговечность возводимой постройки. В связи с этим стоит с ответственностью подойти к этому вопросу. Выбор фундамента во многом зависит от типа грунта, глубины промерзания почвы, ее пучения и других факторов.

После того как был сделан выбор фундамента в ту или иную сторону можно браться за его возведение. Но есть одно, но. После возведения фундамента не стоит сразу же приступать к постройке здания, для которого был возведён фундамент. Это связано с тем, что фундамент должен укрепиться, то есть просесть на грунте. Это потребует немало времени для каждого типа фундамента свой срок.

Но возведение фундамента из блока ФБС значительно сокращает это время. И в этой статье строительного журнала samastroyka.ru будет рассказано о том, как правильно укладывать блоки ФБС и подробнее поговорим о них.

Строительство фундамента из блоков ФБС своими руками

Блоки ФБС применяются для строительства разных масштабов, как от строительства гаража, так и до малоэтажного строения (в несколько этажей). Аббревиатура ФБС расшифровывается как «Фундаментные Блоки Стеновые». Цена на блоки относительно невысока, что тоже является плюсом, а время возведения фундамента значительно сокращается.

Блоки изготавливают обычно с одинаковой высотой, которая составляет 58 см., но остальные параметры у разных блоков разная (длина, ширина, вес). Ширина блоков ФБС подбирается с учетом толщины стен возводимого строения. То есть, ширина фундамента должна быть больше ширины наружной стены. Хотя с блоками ФБС допускается, и свисание, допустим кирпичной стены на 6 см., с обеих сторон и до 10 с одной. Однако не стоит так возводить стены.

Подготовка к установке блоков

Перед началом установки блоков ФБС проводятся земельные работы (рытье котлована или траншеи). Траншеи выкапываются с учетом удобности монтажа блоков. Так же как и при возведении любого другого типа фундамента производится выравнивание траншеи в горизонтальной плоскости.

При возведении фундамента на слабых грунтах для увеличения подошвы фундамента нижний ряд ставят из более широких блоков.

Установка ФБС блоков

В начале установки нового ряда устанавливают так называемый блок-маяк. Эти блоки устанавливают на углах и пересечениях. Обязательно вертикальные швы замазываются раствором. Если осталось пространство между блоками, то оно заливается бетоном. Последующие ряды устанавливаются на слой раствора, толщина слоя равна 1,5 см.

Как в любой кладке делается перевязка рядов, так и при установке ФБС блоков. Перевязка делается, как правило, через каждые 25-60 см. В практике количество рядов в таком фундаменте колеблется в пределах от 2 до 5.

Если нужно возвести фундамент из блоков ФБС под легкие постройки, такие как баня или гараж, то вполне хватит и одного ряда блоков.

Но при этом требуется усилить фундамент и произвести такие действия как:

  • Сделать подушку из гравия и песка высотой в пределах 30 см;
  • Изготовить армированный железобетонный пояс толщиной 10 см;
  • Произвести гидроизоляцию блоков.

Само изготовление фундамента из блоков очень трудоёмкое, но при этом не сложное. При правильном построении такой фундамент прослужит очень долго, поскольку будет обладать большой прочностью.

Оценить статью и поделиться ссылкой:

Ленточный фундамент — презентация онлайн

1. Ленточный фундамент

Основным принципом является заложение фундамента ниже отметки промерзания грунта. Ширина подошвы
для каждого случая индивидуальна и зависит от веса здания и несущей способности грунтов.
Монтаж сборного ленточного фундамента из бетонных блоков ФБС необходимо выполнять с учетом требований СП
70.13330.2012 «Несущие и ограждающие конструкции» Актуализированная редакция СНиП 3.03.01-87
Работы по монтажу фундамента здания относятся к скрытым работам и должны быть зафиксированы актами
освидетельствования скрытых работ.
Разработка котлована.
Монтаж ФБС
1. Укладка фундаментных блоков на промороженное, покрытое льдом, снегом или водой основание запрещается.
2. Фундаментные блоки укладывают на тщательно выровненное песчаное основание или песчано-цементную подушку
толщиной не менее 5 см (на глинистых грунтах основания). Отклонение отметки выравнивающего слоя песка от
проектной не должно превышать -15 мм.
3. Установку блоков начинают с установки маячных блоков в углах здания и на пересечении осей. Маячные блоки
устанавливают, совмещая их осевые риски с рисками разбивочных осей, по двум взаимно перпендикулярным
направлениям. К установке рядовых блоков следует приступать после выверки положения маячных блоков в плане и по
высоте.
4. Кладку фундаментных блоков выполняют на цементном растворе не ниже М-50. Горизонтальные и вертикальные
швы между блоками заполняют раствором на всю толщину стены и высоту шва. Толщина швов не более 20мм.
Наружная несущая стена
Внутренняя несущая стена
Установку блоков стен подвала следует выполнять с соблюдением
перевязки (серия 2.110-1 «Детали фундаментов жилых зданий» выпуск
1 деталь 19). Для индивидуальных жилых домов высотой до трех
этажей необходимая величина перевязки блоков не менее 240мм. Для
определения необходимого количества блоков ФБС нужно сделать
развертку каждой стены на которой нарисовать блоки с учетом их
размеров и соблюдения перевязки.

Руководство по выбору контрольных и блокирующих реагентов.

Экспериментальные протоколы с использованием иммунотехнологий часто можно улучшить за счет оптимального использования блокирующих реагентов, разбавителей и контролей. Прочтите дополнительную информацию о том, как выбрать подходящие разбавители и этапы блокировки для предотвращения нежелательного фона, а также о том, как экспериментальные элементы управления могут помочь определить источник нецелевого сигнала.

Оптимизируйте свои экспериментальные протоколы с помощью контрольных, разбавляющих и блокирующих реагентов.

При разработке иммунотехнологии важно учитывать анализ результатов. Добавление правильных блокирующих реагентов и экспериментальных контролей может улучшить качество анализа и его интерпретацию. Включение положительных и отрицательных контролей важно при создании данных для публикации.

Используйте это руководство, чтобы узнать больше о выборе подходящих контрольных, разбавляющих и блокирующих реагентов для ряда иммунотехнологий:

  • Уменьшить фон
  • Устранение неполадок с нецелевыми сигналами
  • Облегчить анализ.
Проточная цитометрия

Проблемы Решение Указанный продукт
Фон антител, связывающих Fc-рецепторы Блокирует Fc-рецепторы. Нормальная сыворотка хозяина меченого антитела
Используйте вторичное антитело F(abʹ) 2 , чтобы избежать захвата Fc-рецепторами. F(abʹ) 2 вторичные
антитела
Подтверждение того, что первичное связывание антител обусловлено антигенной специфичностью Используйте изотипический отрицательный контроль (неспецифический IgG того же вида, что и первичное антитело), ​​чтобы продемонстрировать специфическое связывание первичного антитела. Очищенные белки ChromPure™
Подтверждение того, что вторичное антитело не влияет на нецелевой сигнал Используйте изотипический отрицательный контроль (конъюгированный неспецифический IgG того же вида, что и вторичное антитело), ​​чтобы продемонстрировать специфическое связывание вторичного антитела. Очищенные белки ChromPure™
Недостаток времени и отсутствие непосредственно конъюгированного первичного Fab пометьте ваши первичные антитела перед инкубацией с образцом. ФабуЛайт™
Вестерн-блоттинг

Проблемы Решение Указанный продукт
Фон (неспецифический сигнал, перекрывающий интересующие полосы) Используйте соответствующий блокирующий реагент для блокирования мембраны перед инкубацией с первичными антителами. Нормальная сыворотка (5% об./об.) вида-хозяина меченого антитела или БСА (5% вес./об.) (без IgG и без протеазы)
Избегайте использования молока или БСА, если используются первичные антитела, полученные от коз, лошадей или овец.Бычий IgG может взаимодействовать с антителом за счет гомологичных эпитопов близкородственных видов. Нормальная сыворотка (5% по объему) вида-хозяина меченого антитела
Интерференция из-за сниженного количества иммунопреципитирующих (IP) антител при обнаружении белков 50 или 25 кДа Чтобы избежать обнаружения тяжелых цепей IP-антител с молекулярной массой 50 кДа, проведите блот-зонд с конъюгированными специфическими антителами против легких цепей. Антитела против легких цепей
Чтобы избежать обнаружения легких цепей IP-антитела с молекулярной массой 25 кДа, проведите блот-зонд с конъюгированным анти-IgG, Fc-фрагментом, специфичным после блокирования моновалентным Fab-фрагментом анти-Fc (FabuLight™). Анти-Fc-специфические антитела

Фрагменты Fab (FabuLight™)

 

Чтобы подтвердить активность репортерного фермента, добавьте небольшой образец конъюгированного вторичного фермента непосредственно к субстрату и наблюдайте за ожидаемой реакцией.

ИФА

Проблемы Решение Указанный продукт
Фон Используйте соответствующий объем блокирующего реагента, чтобы полностью заблокировать лунки перед инкубацией с первичным антителом. Нормальная сыворотка (5% об./об.) вида-хозяина с меченым антителом или БСА (5% вес./об.) (без IgG и без протеазы)
Нет сигнала Используйте положительный контроль, чтобы продемонстрировать активность меченого вторичного антитела, покройте изотипом первичного антитела и непосредственно определите с помощью вторичного антитела Очищенные белки ChromPure™
Меры предосторожности при блокировании бычьим сывороточным альбумином (БСА) или молоком:

Бычий сывороточный альбумин (БСА) и сухое молоко иногда содержат бычий IgG.За исключением Bovine Anti-Goat IgG компании Jackson ImmunoResearch, многие вторичные антитела, такие как Anti-Bovine, Anti-Goat и Anti-Sheep, будут реагировать с бычьим IgG. Следовательно, использование БСА или сухого молока для блокирования или разбавления может значительно увеличить фон и/или снизить титр антител. Для блокировки используйте обычную сыворотку (5% об./об.) вида-хозяина меченого вторичного антитела.

Дополнительная информация о БСА, не содержащем IgG и протеаз, от Jackson ImmunoResearch.

ВВК

Проблемы Решение Указанный продукт
Подтверждение того, что первичное связывание антител обусловлено антигенной специфичностью Используйте изотипический отрицательный контроль (неспецифический IgG того же вида, что и первичное антитело), ​​чтобы продемонстрировать специфическое связывание первичного антитела. Протеины ChromPure™
Фон (общий) Блокирует эндогенные сайты связывания, которые могут взаимодействовать с экспериментальными реагентами. Нормальная сыворотка хозяина меченого антитела.
Развести антитела в буфере без белков-носителей. Отцентрифугировать рабочий раствор для удаления агрегатов. Правильный разбавитель и подготовка, т.е. PBS/Твин 20
Фон (распознавание гомологичного Ig) Используйте перекрестно-адсорбированные вторичные антитела с минимальной перекрестной реактивностью к анализируемым видам клеток или тканей. Вторичные антитела Min X
Блокируют эндогенные иммуноглобулины. Фрагменты Fab
Множественное мечение первичных антител
от одного и того же вида хозяина (например, мышь на мыши)
Используйте Fab-фрагменты в предлагаемых протоколах для выполнения множественной маркировки (см. онлайн). Фрагменты Fab
Иммунологическая метка первичного антитела перед инкубацией. ФабуЛайт™
Эндогенные ферменты Инактивация эндогенных пероксидаз перекисью водорода. Перекись водорода
Инактивация эндогенных фосфатаз левамизолом. Левамизол
Эндогенный биотин Блокирует эндогенный биотин. Инкубируйте со стрептавидином, а затем со свободным биотином.
Ионные или гидрофобные
взаимодействия
Включите моющее средство в буферы, оптимизируйте концентрацию соли и pH. Твин 20 и/или Тритон Х-100

Иммунореагенты

Компания Jackson ImmunoResearch предлагает широкий спектр иммунореагентов, предназначенных для повышения эффективности и простоты анализа.Приведенные ниже иммунореагенты выделены в этом руководстве. Посетите наш веб-сайт или ознакомьтесь с нашим каталогом для получения дополнительной информации о широком ассортименте вторичных антител и конъюгатов, производимых компанией Jackson ImmunoResearch.

  • Обычные сыворотки
  • Очищенные белки ChromPure™ из нормальных сывороток
  • Моновалентные Fab-фрагменты аффинно-очищенных антител
  • Бычий сывороточный альбумин, не содержащий IgG и протеазы

Если вам требуется дополнительная поддержка при выборе антител или у вас возникли проблемы с экспериментом, свяжитесь с нашей технической командой по адресу [email protected]ком.

Нормальные сыворотки

Нормальные сыворотки получают от неиммунизированных животных и, следовательно, не обнаруживают какой-либо специфический антиген. Обычная сыворотка, разбавленная до 5% (об./об.) в PBS (или аналогичном буфере), настоятельно рекомендуется в качестве блокирующего агента для снижения фона от неспецифического связывания с консервативной последовательностью и/или Fc-рецептором. Наилучшие результаты получаются с разбавленной нормальной сывороткой того же хозяина, что и меченое антитело, используемой в качестве отдельного этапа инкубации перед добавлением первичного антитела.

ChromPure™ Очищенные белки из нормальных сывороток
Белки

ChromPure™ в основном используются в качестве экспериментальных контролей первичных или вторичных антител. Их также можно использовать в качестве блокирующих реагентов для Вестерн-блоттинга, IHC и IF. Белки ChromPure™ получают из сыворотки неиммунизированных животных и не распознают какие-либо известные антигены. Они готовятся с использованием различных хроматографических методов для получения материала без загрязняющих молекул вплоть до концентрации 20 мг/мл, что делает их идеальными для использования в качестве экспериментальных контролей для наиболее чувствительных анализов.Белки ChromPure™ доступны в различных форматах для многих видов, включая цельный иммуноглобулин, F(ab’) 2 и Fab-фрагменты.

Также доступны

человеческий IgM, сывороточный IgA и другие белки. Компания Jackson ImmunoResearch предлагает широкий спектр конъюгатов для этой линейки продуктов, в том числе ряд флуоресцентных красителей и репортерных ферментов, позволяющих изолировать сигнал, полученный в результате неспецифических взаимодействий.

Фрагменты моновалентных Fab
Фрагменты

Affinity-Purified AntibodiesFab можно использовать для блокирования эндогенных иммуноглобулинов с целью уменьшения фонового окрашивания и двойной маркировки первичных антител одного и того же вида-хозяина.В следующем примере показано, как можно использовать Fab-фрагменты для блокирования эндогенных иммуноглобулинов при использовании мышиных первичных антител на ткани мыши.

Бычий сывороточный альбумин, не содержащий IgG и протеазы

Бычий сывороточный альбумин (БСА) широко используется в качестве белка-носителя для разбавления антител и в качестве общего блокатора белка в иммуноанализах и протоколах иммунодетекции. Если BSA является желательным разбавителем или блокирующим реагентом для вашего анализа, важно использовать BSA, подходящий для этой цели.

Большинство продуктов BSA, в том числе те, которые продаются как не содержащие обнаруживаемых IgG, загрязнены низкими уровнями бычьего IgG.

Бычий IgG имеет много общих эпитопов с козьим, овечьим и лошадиным IgG и может стать мишенью для вторичных антител, направленных против этих видов (исключение составляет бычий антикозий IgG). Это может произойти и с другими антителами, которые перекрестно реагируют с бычьим IgG. Взаимодействие может привести к потере активности антител и/или увеличению фона.Фон может возникать из-за липких, растворимых иммунных комплексов или из-за неспецифического связывания контаминирующего бычьего IgG, привлекающего перекрестно реагирующие меченые вторичные антитела.

Бычий сывороточный альбумин

Jackson ImmunoResearch не содержит IgG и протеазы. Он не содержит загрязняющих IgG, что устраняет общие проблемы иммуноанализа, связанные со многими коммерческими препаратами БСА высокой чистоты. БСА без IgG поставляется в виде чистого белка, высушенного вымораживанием из деионизированной воды, в упаковках по 10 г, 50 г и 250 г.


Каталожные номера :

  • Alberts B et al (1994) Молекулярная биология клетки. 3-е изд. Гирлянда Пресс. Лондон.
  • Калюжный А. (2016) Иммуногистохимия – основные элементы и не только. Springer International Publishing Швейцария.
  • Манн, М. и Дженсен, О.Н. (2003) Протеомный анализ посттрансляционных модификаций. Нац. Биотехнолог. 21, 255-261.

Стратегии блокировки для IHC | Термо Фишер Сайентифик

Перед использованием специфических антител для обнаружения антигенов с помощью иммуногистохимии (ИГХ) все потенциальные сайты неспецифического связывания в образце ткани должны быть заблокированы, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител.Если блокирование отсутствует или является неадекватным, антитела или другие реагенты для детекции могут связываться с различными сайтами, не связанными со специфической реактивностью антитело-антиген. Например, антитела могут связываться со многими типами поверхностей путем простой адсорбции, и они могут связываться с белками благодаря зарядовым, гидрофобным и другим типам взаимодействий.


Введение

В принципе, любой белок, который не связывается специфически с целевым антигеном или антителами и другими реагентами для детекции в анализе, можно использовать для блокирования.Однако на практике некоторые белки работают лучше, чем другие, потому что они легко связываются с неспецифическими сайтами (также называемыми реактивными сайтами) при нейтральном pH или стабилизируют функцию других компонентов анализа. Однако ни один белок или смесь белков не подходят лучше всего для всех экспериментов IHC, и эмпирическое тестирование имеет решающее значение для получения наилучших возможных результатов для данной комбинации специфических антител и других реагентов для обнаружения. В приведенном ниже примере блокирующий буфер Thermo Scientific Blocker BSA использовался в эксперименте с флуоресцентной IHC для обнаружения белков виментина и ламина B1.


Флуоресцентная ИГХ для обнаружения виментина и ламина B1 в нормальной ткани толстой кишки. Срезы нормальной ткани толстой кишки человека блокировали блокирующим буфером Blocker BSA (кат. № 37520, 37525) перед инкубацией с мышиным анти-виментином (например, кат. № MA5-14564) и кроличьим антиламиновым B1 (например, . # MA1-06103) первичные антитела. Используемые вторичные антитела представляли собой меченный Invitrogen DyLight 405 козий антимышиный IgG (кат. № 35501BID, синий сигнал) или меченный DyLight 550 козий антикроличий IgG (кат.# 84541, розовато-оранжевый сигнал) соответственно. Ядра клеток были контрастно окрашены в зеленый цвет (например, номер по каталогу S7572)


Общие процедуры блокировки

Этап блокировки для ИГХ чаще всего выполняется после завершения всех других этапов подготовки образца, но непосредственно перед инкубацией образца с первичным антителом. Общий протокол заключается в инкубации фиксированного, встроенного, смонтированного, срезанного, депарафинированного и немаскированного образца IHC с соответствующим блокирующим буфером в течение от 30 минут до ночи при температуре окружающей среды или 4 ° C на основе оптимизированного протокола, специфичного для каждого антитела. и целевой антиген.После этапа блокировки обычно выполняется достаточная промывка, чтобы удалить избыток белка, который может помешать обнаружению целевого антигена. Однако многие исследователи не проводят промывку после этапа блокирования, потому что они разбавляют свои первичные антитела в блокирующем буфере.


Типы блокирующих буферов

Нормальная сыворотка

Нормальная сыворотка с концентрацией 1–5 % (вес/объем) является распространенным блокирующим буферным компонентом, поскольку сыворотка содержит антитела, которые связываются с реактивными участками и предотвращают неспецифическое связывание вторичных антител, используемых в анализе.Однако решающим фактором является использование сыворотки вида-источника для вторичного антитела, а не вида-источника для первичного антитела. Это связано с тем, что сыворотка первичных видов антител будет связываться с реактивными сайтами, но вторичное антитело будет распознавать эти неспецифически связанные антитела вместе со специфическими антителами, связанными с антигеном-мишенью. Кроме того, сыворотка богата альбумином и другими белками, которые легко связываются с неспецифическими участками связывания белков в образце.

Белковые растворы

Блокирующие буферы помимо сыворотки часто содержат белки, такие как бычий сывороточный альбумин (БСА), желатин или обезжиренное сухое молоко, добавленные в конечной концентрации 1-5% (масса/объем). Эти недорогие и легкодоступные белки по отдельности или вместе присутствуют в значительном избытке по сравнению с концентрацией антител, поэтому они конкурируют с последними за связывание с неспецифическими сайтами в образце. У многих лабораторий есть любимый рецепт самодельного блокирующего буфера. Однако важно убедиться, что такие блокирующие буферы не содержат осадков и других загрязнителей, которые могут помешать обнаружению ИГХ.

Готовые коммерческие буферы

Готовые блокирующие буферы также доступны для блокирования образцов при подготовке к обработке антителами. Эти буферы могут содержать высокоочищенные отдельные белки или запатентованные безбелковые соединения. Преимущество использования коммерческих блокаторов заключается в том, что существует множество доступных вариантов, которые работают лучше, чем желатин, казеин или другие белки, используемые по отдельности, и у них больше срок годности по сравнению с домашними препаратами.


Мы предлагаем несколько важных советов для ваших экспериментов по блокированию:

  • Контролируйте как фон (отрицательный контроль), так и силу сигнала (положительный контроль) с помощью различных блокирующих реагентов.
  • Выберите блокирующий буфер, обеспечивающий максимальное отношение сигнал/шум.
  • Убедитесь, что в блокирующем буфере нет веществ, которые мешают конкретному анализу. Например, обезжиренное сухое молоко содержит биотин и не подходит для использования с любой системой обнаружения , включающей биотин-связывающий белок.
  • Для оптимальных условий анализа используйте тот же блокирующий буфер для разбавления антитела, который используется на этапе блокирования.

  1. Дакшинамурти К., Мистри С.П. (1963) J Biol Chem 238:294.

Предотвращение неспецифического окрашивания: R&D Systems

После надлежащей подготовки и фиксации образцов тканей или клеток они готовы к окрашиванию. Все исследования IHC/ICC зависят от специфического связывания антитело-эпитоп, которое регулируется гидрофобными взаимодействиями, ионными взаимодействиями, водородными связями и другими межмолекулярными силами. Однако те же силы притяжения могут также приводить к неспецифическому окрашиванию, т. е. к связыванию первичного антитела с аминокислотами, отличными от тех, которые находятся в пределах желаемого эпитопа антигена.Это обычная проблема, возникающая в экспериментах IHC/ICC. Задача состоит в том, чтобы уменьшить неспецифические взаимодействия без нарушения связывания антитела с эпитопом. Причины неспецифического окрашивания включают взаимодействие первичных и вторичных антител с белками сыворотки, ионное взаимодействие между антителами и тканями и взаимодействие с эндогенными молекулами, способными повлиять на используемую систему обнаружения ИГХ. Эти проблемы могут привести к высокому фону и невозможности визуализировать интересующий антиген в его соответствующей клеточной локализации.Проблемы с окрашиванием этого типа можно решить путем блокирования неспецифических взаимодействий с помощью блокирующего реагента. Эти шаги выполняются до инкубации образца с первичным антителом.

Предотвращение неспецифических гидрофобных взаимодействий

Хотя гидрофобные взаимодействия играют существенную роль в связывании эпитоп-антитело, эти силы также могут способствовать неспецифическому связыванию. Большинство белков обладают некоторой степенью гидрофобности из-за нейтральных боковых цепей некоторых аминокислот.Инкубация тканей с инактивированной нагреванием нормальной сывороткой или бычьим сывороточным альбумином (БСА) является обычной процедурой, используемой для уменьшения неспецифического гидрофобного связывания. Выбор типа нормальной сыворотки важен для предотвращения взаимодействия с первичными или вторичными антителами или с окрашиваемыми тканями/клетками. Например, козья сыворотка не рекомендуется в качестве блокирующего реагента для использования с первичными антителами козьего происхождения. Вместо этого рекомендуется использовать сыворотку, идентичную сыворотке животного-хозяина вторичного антитела или сыворотку неродственного вида.BSA и обезжиренное сухое молоко также часто используются в качестве блокирующих реагентов. Один из этих реагентов обычно включается в разбавители для первичных и вторичных антител. Добавление неионогенных детергентов, включая 0,3% Triton X-100™ или Tween 20™, также может уменьшить неспецифические гидрофобные взаимодействия.

Блокирование неспецифического связывания с сывороткой. А . CD14 обнаруживали в ткани миндалин человека, залитой в парафин, с использованием биотинилированных аффинно-очищенных поликлональных антител против CD14 человека (каталожный № BAF383).Ткань подвергали извлечению антигена с использованием набора Basic Antigen Retrieval Kit (каталожный номер CTS013). Ткани окрашивали с использованием высокочувствительного стрептавидина, конъюгированного с HRP (HSS-HRP) и DAB, и контрастно окрашивали гематоксилином (синий). Б . Неспецифическое фоновое окрашивание заметно снижается в параллельном эксперименте, который включает стадию блокирования с использованием сыворотки животных в течение 15 минут при комнатной температуре перед инкубацией с первичным антителом. HSS-HRP и сыворотки животного происхождения включены во все наборы R&D Systems для окрашивания клеток и тканей.

Предотвращение неспецифических ионных взаимодействий

Если используемое антитело и ткань-мишень имеют суммарный противоположный заряд, ионные взаимодействия могут вызвать неспецифическое фоновое окрашивание. Например, неспецифическое окрашивание может быть связано с притяжением противоположных карбоксильных и аминогрупп. Силы Ван-дер-Ваальса, слабые электростатические взаимодействия между диполярными молекулами, также могут вносить свой вклад. Повышение ионной силы фиксатора и/или буфера для разведения антител может уменьшить взаимодействие ионов.Однако связывание эпитоп-антитело обычно зависит от ионных сил, поэтому этот подход также может негативно повлиять на специфичность окрашивания. Из-за их специфичности к одному эпитопу увеличение ионной силы с большей вероятностью ухудшит эффективность моноклональных, чем поликлональных антител.

Интерференция эндогенных ферментов

Методы хромогенной детекции часто используют конъюгированный фермент для визуализации взаимодействий эпитоп-антитело. При использовании этого метода детекции необходимо блокировать эндогенную активность того же фермента.Например, протоколы, которые включают пероксидазу хрена (HRP) или щелочную фосфатазу (AP), могут потребовать реагентов для предотвращения неспецифических сигналов. Такие ткани, как почки, печень или участки сосудов с эритроцитами, обладают активностью эндогенной пероксидазы. Реагенты, блокирующие пероксидазу, содержащие 3-10% H 2 O 2 , можно использовать для предотвращения расщепления субстрата эндогенной пероксидазой. Эндогенные АТ, обнаруживаемые в кишечнике, почках, лимфоидной и других тканях, можно блокировать 1 мМ левамизола.Левамизол не влияет на кишечную форму ОП, но ее можно заблокировать с помощью 1% уксусной кислоты.

Подавление активности эндогенной пероксидазы. А . Неспособность подавить эндогенную пероксидазу перед окрашиванием приводила к ложноположительному сигналу в срезах почек человека. Ткани окрашивали с использованием набора для окрашивания клеток и тканей против козьего HRP-DAB (каталожный № CTS008; коричневый). Б . Активность эндогенной пероксидазы гасили в той же ткани с использованием 3% H 2 O 2 в метаноле в течение 15 минут при комнатной температуре перед окрашиванием.

Интерференция эндогенного биотина

Связывание стрептавидина с биотинилированными первичными или вторичными антителами является еще одной распространенной системой обнаружения, которая используется для экспериментов IHC/ICC. Поэтому перед инкубацией со стрептавидином необходимо блокировать эндогенный биотин. Эндогенный биотин обнаружен во многих тканях, включая печень, почки, сердце, мозг и легкие. Предварительная инкубация образца с авидином обычно используется для блокирования эндогенного биотина. За этим должна следовать последующая инкубация с биотином, чтобы заблокировать дополнительные сайты связывания биотина на молекуле авидина.После этих шагов блокировки биотина/авидина образец можно инкубировать с первичным антителом.

Triton X-100 является товарным знаком Dow Chemical Corporation.
Tween является торговой маркой ICI Americas.

Блокировка для IHC | Абкам

Блокирование белков для ИГХ

Блокирование сывороткой или реагентом, блокирующим белок, предотвращает неспецифическое связывание антител с тканями или с Fc-рецепторами. Теоретически для блокирования можно использовать любой белок, не связывающийся с целевым антигеном.На практике некоторые белки легче связываются с неспецифическими сайтами.

Сыворотка является распространенным блокирующим агентом, поскольку она содержит антитела, которые связываются с неспецифическими сайтами. Рекомендуется использовать сыворотку, соответствующую виду вторичного антитела. При выполнении многократного окрашивания с использованием вторичных антител разных видов может оказаться необходимым использовать блокирующие сыворотки видов обоих вторичных антител.

Просмотрите нашу нормальную козью сыворотку, нормальную ослиную сыворотку или полный список сывороток для блокирования IHC.

Белки, такие как BSA или казеин, также могут использоваться для блокирования неспецифического связывания антител, и с ними нет необходимости подбирать реагент для видов вторичного антитела.

Специализированные блокирующие буферы также часто используются для блокирования неспецифического связывания антител. Они часто разрабатываются для оптимизации производительности и/или срока годности.

Просмотр буферов для блокировки белков.

Блокирование при использовании антител мыши на тканях мыши

При окрашивании тканей мыши первичными антителами мыши часто наблюдается высокий фон, поскольку антимышиные вторичные антитела связываются с эндогенными рецепторами IgG и Fc мыши.Это фоновое связывание можно уменьшить с помощью фрагментов F(ab), как описано в этом протоколе. Часто важно тщательно подобрать блокирующий фрагмент и используемое вторичное антитело.

Набор View для блокирования и обнаружения мышиных антител, используемых на тканях мыши.

Блокирование биотина

Если используется система обнаружения на основе биотина, рекомендуется блокирование эндогенного биотина. Биотин присутствует во многих тканях, особенно в почках, печени и головном мозге. Он блокируется путем предварительной инкубации ткани с авидином с последующей инкубацией с биотином, чтобы заблокировать дополнительные сайты связывания биотина на молекуле авидина.

Посмотреть реагент, блокирующий биотин. В качестве альтернативы, при использовании системы обнаружения на основе полимера нет необходимости в блокировании биотина.

Блокирование эндогенных ферментов

Методы хромогенной детекции обычно используют фермент, прямо или косвенно связанный со вторичным антителом, для визуализации локализации антитела. Если фермент естественным образом присутствует в исследуемой ткани, его активность необходимо заблокировать перед этапом обнаружения.

Блокирование пероксидазы

При использовании HRP для обнаружения может возникать неспецифическое окрашивание или окрашивание с высоким фоном из-за активности эндогенной пероксидазы.Такие ткани, как почки, печень и ткани, содержащие эритроциты (например, сосудистая ткань), содержат эндогенные пероксидазы. Для проверки активности эндогенной пероксидазы ткани можно инкубировать с субстратом DAB до инкубации с первичными антителами. Если ткани становятся коричневыми, присутствует эндогенная пероксидаза, и требуется стадия блокировки. 10-15-минутной инкубации в 0,3% перекиси водорода обычно достаточно для блокирования.

Посмотреть блокирующий реагент перекиси водорода и набор субстратов DAB.

Блокирование щелочной фосфатазы

Эндогенная щелочная фосфатаза (ЩФ) может создавать высокий фон при использовании ЩФ для обнаружения. Его можно найти в почках, кишечнике, остеобластах, лимфоидной ткани и плаценте. Активность АП выше в замороженных тканях. Ткань можно проверить на наличие эндогенного АР путем инкубации с BCIP/NBT; если наблюдается синий цвет, присутствует эндогенный ПД и необходима блокировка. Левамизол используется для блокирования и добавляется с хромогенным субстратом.Кишечный АР блокируют слабой кислотой (например, 1% уксусной кислотой) перед добавлением первичного антитела.

Уменьшение аутофлуоресценции при ИГХ

При использовании флуоресцентной метки для обнаружения существует вероятность того, что ткань может быть аутофлуоресцентной, что приводит к высокому фону. Фиксация ткани может вызвать автофлуоресценцию, особенно при использовании альдегидных фиксаторов (например, формалина), которые реагируют с аминами с образованием флуоресцентных продуктов.

Автофлуоресценция также может быть вызвана присутствием флуоресцентных соединений, таких как флавины и порфирины.Эти соединения могут быть извлечены из ткани с помощью растворителей, используемых для получения неподвижных обезвоженных срезов. Однако они сохраняются в замороженных срезах, обработанных водными реагентами.

Для уменьшения автофлуоресценции используйте неальдегидные фиксаторы, такие как раствор Карнуа, или блокируйте альдегиды путем обработки боргидридом натрия или глицином/лизином. В качестве альтернативы попробуйте использовать замороженные срезы ткани или обработать ткань гасящими красителями, такими как понтаминовый небесно-голубой, суданский черный, трипановый синий или блок FITC,


.

View Агент, блокирующий белок FITC, используемый для уменьшения аутофлуоресценции.


>> Следующая страница: иммуноокрашивание

<< Предыдущая страница: пермеабилизация

Загрузить полное руководство IHC

IHC Блокировка | Протеинтек Групп

Что такое блокирование в иммуногистохимии?

Блокирование необходимо для предотвращения неспецифического связывания антител или других реагентов с тканью.Даже если антитело обладает высокой специфичностью по отношению к мишени, межмолекулярные силы могут способствовать неспецифическому связыванию с другими молекулами. Следовательно, неспецифическое связывание препятствует визуализации представляющего интерес связывания антиген-антитело. Чтобы смягчить неспецифическое связывание, перед инкубацией с первичным антителом необходимо провести стадию блокирования.

Типы блокировки IHC
Блокирование неспецифических ионных связей

Неспецифические ионные связывания обусловлены, например, ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями, диполь-дипольными взаимодействиями или суммарными зарядами определенных аминокислотных групп.В этом случае изменение ионной силы буфера для разведения антител может помочь уменьшить неспецифическое связывание ионов.

Блокирование эндогенных ферментов

При использовании антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP) или щелочной фосфатазой (AP), для обнаружения необходимо блокировать эндогенные уровни фермента. Обычно это относится к таким тканям, как почки, печень, кишечник, лимфоидная ткань и т. д. Пероксидазу можно заблокировать буферами, содержащими H₂O₂, а AP можно заблокировать буферами, содержащими уксусную кислоту или левамизол.

 

 

 
Блокирование белков

Обычно для блокирования используют сыворотку (того же вида, что и вторичное антитело) или бычий сывороточный альбумин (БСА). Сыворотки и БСА могут помочь предотвратить неспецифическое связывание со многими гидрофобными боковыми цепями белков, присутствующих в ткани. Если вы окрашиваете несколькими антителами, вам необходимо использовать блокирующую сыворотку против всех используемых вторичных антител.Если используется BSA, добавление 0,1–0,5% Triton-X или Tween может помочь предотвратить неспецифическое связывание.

 
Блокирующие наконечники IHC
  1. Выберите лучший блокирующий раствор при работе с отрицательными и положительными контрольными образцами, чтобы установить порог фонового окрашивания.

  2. Используйте блокирующий буфер для приготовления разведения антител.

  3. Убедитесь, что ваш блокирующий буфер не мешает вашему методу обнаружения сигнала.

Вирусы гриппа А используют поливалентные кластеры сиаловой кислоты для связывания клеток и активации рецепторов

Abstract

Вирус гриппа А (IAV) связывается со своей клеткой-хозяином, используя основной вирусный поверхностный белок гемагглютинин (HA). ГК распознает сиаловую кислоту, гликан плазматической мембраны, который действует как специфический первичный фактор прикрепления (AF). Поскольку сиаловая кислота сама по себе не может выполнять сигнальную функцию, вирусу необходимо активировать нижестоящие факторы, чтобы вызвать поглощение эндоцитами.Недавно было показано, что рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), член семейства рецептор-тирозинкиназа, активируется IAV и передает сигналы входа в клетку. Однако то, как связывание IAV с сиаловой кислотой приводит к вовлечению и активации EGFR, остается в значительной степени неясным. Мы использовали многоцветную микроскопию сверхвысокого разрешения для изучения латеральной организации AFs IAV и его функционального рецептора EGFR в масштабе частицы IAV. Интересно, что количественный кластерный анализ показал, что AFs и EGFR организованы в частично перекрывающиеся субмикрометровые кластеры в плазматической мембране клеток A549.Внутри доменов AF локальная концентрация AF достигает в среднем 10-кратной фоновой концентрации и имеет тенденцию к увеличению по направлению к центру кластера, тем самым представляя мультивалентную платформу для связывания вируса. Используя наши экспериментально измеренные характеристики кластера, мы смоделировали диффузию вируса на плоской мембране. Результаты предсказывают, что локальная концентрация AF сильно влияет на отчетливый характер подвижности IAV, что согласуется с данными отслеживания отдельных вирусов живых клеток. В отличие от ФП, EGFR находится в более мелких кластерах.Связывание вируса активирует EGFR, но, что интересно, этот процесс происходит без основного латерального перераспределения EGFR, что указывает на активацию предварительно сформированных кластеров, которые, как мы показываем, являются долгоживущими. В совокупности наши результаты дают количественное представление о начальных этапах заражения вирусом гриппа. Совместная кластеризация AF и EGFR делает возможным совместный эффект связывания и передачи сигналов на специфических платформах, тем самым связывая их пространственную организацию с их функциональной ролью во время связывания вируса с клеткой и активации рецептора.

Резюме автора

Плазматическая мембрана является основным интерфейсом между клеткой и окружающей средой. Эта сложная и динамичная органелла должна защищать как барьер, а также передавать тонкие сигналы в клетку и из нее. Для оболочечного вируса IAV плазматическая мембрана представляет собой как основное препятствие, которое необходимо преодолеть во время инфекции, так и место сборки дочерних вирусных частиц. Однако организация плазматической мембраны — ключ к пониманию того, как работает проникновение вируса — в масштабе заражающей частицы (масштабы длины <100 нм) остается в значительной степени неизвестной.Сиалилированные гликаны служат факторами прикрепления IAV, но не способны передавать сигналы через плазматическую мембрану. Было установлено, что рецепторные тирозинкиназы активируются при связывании вируса и служат функциональными рецепторами. Как IAV задействует и активирует свои функциональные рецепторы, в то время как первоначально связывает гликаны, все еще остается спекулятивным. Здесь мы используем микроскопию сверхвысокого разрешения для изучения латеральной организации молекул, связанных с плазматической мембраной, участвующих в инфекции IAV, а также их функциональных взаимоотношений.Мы обнаруживаем, что молекулы организованы в субмикрометровые нанодомены и, в сочетании с моделированием диффузии вируса, представляют механистическую модель того, как IAV сначала взаимодействует с AFs в плазматической мембране, чтобы впоследствии задействовать и активировать мембранные рецепторы, связанные с проникновением.

Образец цитирования: Sieben C, Sezgin E, Eggeling C, Manley S (2020) Вирусы гриппа A используют мультивалентные кластеры сиаловой кислоты для связывания клеток и активации рецепторов. ПЛОС Патог 16(7): е1008656.https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656

Редактор: Yoshihiro Kawaoka, University of Wisconsin-Madison, USA

Поступила в редакцию: 24 апреля 2020 г.; Принято: 27 мая 2020 г .; Опубликовано: 8 июля 2020 г.

Авторское право: © 2020 Sieben et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Данные, лежащие в основе результатов, представленных в исследовании, доступны по адресу https://doi.org/10.5281/zenodo.3897432.

Финансирование: Исследования в лаборатории С.М. поддерживаются Национальным центром научных исследований (NCCR) в области химической биологии. Э.С. поддерживается долгосрочной поддержкой EMBO (ALTF 636-2013) и внутриевропейских стипендий Марии Склодовской-Кюри (MEMBRANE DYNAMICS 627088). Эта работа поддерживается Фондом Вольфсона (ссылка 18272), Советом по медицинским исследованиям (MRC, номер гранта MC_UU_12010/единица программы G08 и MC_UU_12025), MRC/BBSRC/ESPRC (номер гранта MR/K01577X/1) и Wellcome Траст (грант исх.104924/14/З/14). Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Вирусы гриппа А (IAV) вызывают у людей тяжелые инфекции дыхательных путей, часто приводящие к сезонным локальным эпидемиям, а также к периодическим глобальным пандемиям [1]. Во время связывания клеток IAV взаимодействует с факторами прикрепления с низким сродством (AF), а также с функциональными рецепторами, чтобы вызвать проникновение клеток путем эндоцитоза.Однако мало что известно о латеральной совместной организации как в масштабе заражающего вируса, так и о том, как их организация связана с их функциональной ролью во время вирусной инфекции.

Вирусный гемагглютинин (HA), тримерный гликопротеин, который покрывает ~ 90% поверхности вируса, опосредует первоначальный контакт IAV с клеткой (рис. 1A) [2]. Наиболее распространенным AF для IAV является N-ацетилнейраминовая или сиаловая кислота (SA), очень распространенный гликан клеточной поверхности, который в своей глиозидной связи кодирует видовую специфичность IAV.Штаммы ВГА, патогенные для человека, предпочтительно связывают α-2,6-связанный СК, в то время как вирусы, патогенные для птиц, предпочитают связывать α-2,3-связанный СК. Эту специфичность можно объяснить топологией гликанов, которые легче образуют контакты с рецепторсвязывающими доменами комплементарных ГК [3]. Общей чертой гликан-белковых взаимодействий является их низкое сродство, которое к ГК-сиаловой кислоте лежит в миллимолярном диапазоне [4] и должно затруднять для вируса формирование устойчивых взаимодействий с клетками. Хотя AF очень распространены, что может привести к стабильной адгезии, отслеживание одного вируса показало, что IAV имеют некоторую свободу исследовать клеточную поверхность [5-7].Действительно, остается в значительной степени неясным, как начальное низкоаффинное взаимодействие приводит к стабильному и специфичному, но также и динамическому контакту вирус-клетка, обеспечивающему успешную инфекцию.

Рис. 1. Сиалилированные факторы прикрепления IAV организованы в нанодомены на клетках A549.

( A ) Вирус гриппа представляет собой оболочечную частицу, которая инкапсулирует свой сегментированный (-) вРНК геном, построенный из 8 вирусных рибонуклеопротеиновых комплексов (вРНП). Вирусная мембрана содержит два гликопротеина гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA).ГК отвечает за связывание сиаловой кислоты (СК), содержащей факторы прикрепления, на плазматической мембране клетки-хозяина. После связывания с клеткой вирус должен активировать функциональные рецепторы, чтобы вызвать эндоцитоз. ( B ) Конфокальная визуализация живых клеток A549, меченных SNA (конъюгированных с JF549). Клетки характеризуются неравномерным распределением SNA по всей плазматической мембране. На дорсальной стороне клетки можно наблюдать крупные пальцевидные выпячивания. ( C ) Конфокальная и STED визуализация живых клеток клеток A549, меченных SNA (конъюгированных со StarRed), подтверждает наличие пальцевидных выступов, а также популяции более мелких нанодоменов диаметром ~ 100 нм ( C , справа, вставка).( D ) Чтобы увеличить разрешение и сфокусироваться на небольшом нанодомене, мы выполнили STORM-изображение клеток A549, помеченных SNA (конъюгированных с Alexa647). Реконструированные изображения STORM подтверждают две основные структурные особенности (1) пальцевидные выступы, а также (2) небольшие нанодомены. Обработка клеток нейраминидазой (NA, 0,01 ЕД/мл в течение 2 ч) приводила к сильному снижению плотности локализации из-за расщепления и, следовательно, к снижению локальной концентрации SA ( D , справа, вставка).

https://дои.org/10.1371/journal.ppat.1008656.g001

После связывания IAV проникают в клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, где было показано, что клатрин-опосредованный эндоцитоз составляет основной [7], хотя и не единственный путь [8]. Поскольку АФ не могут запускать эндоцитоз, должен быть задействован активный рецептор, обрабатывающий сигналы, чтобы обеспечить проникновение вируса. Показано, что эту функцию способны выполнять рецептор-тирозинкиназы [9]. В частности, было показано, что среди других рецептор-тирозинкиназ рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) активируется во время и необходим для эффективного проникновения IAV в клетки.Однако вопрос о том, как IAV находит и активирует EGFR, остается спекулятивным. В то время как молекулярная и структурная информация доступна как для взаимодействий HA-SA [3], так и для взаимодействий EGFR-EGF [10], гораздо меньше известно об их пространственной совместной организации внутри плазматической мембраны и о том, как это может способствовать активации EGFR во время инфекции клеток IAV. .

Электронная микроскопия за последние десятилетия позволила получить подробную структурную картину изолированных частиц вируса гриппа [2], а также их отдельных белков [11].Однако визуализация и количественный анализ гетерогенных клеточных структур и их динамики в наномасштабе остаются сложной задачей. Микроскопия сверхвысокого разрешения представляет собой превосходный инструмент для изучения клеточной организации в масштабе заражающей вирусной частицы (<100 нм) [12]. Здесь мы объединили два взаимодополняющих подхода, которые вместе обеспечивают универсальный набор инструментов для решения этой задачи [12,13]. Мы использовали методы микроскопии локализации одиночных молекул (SMLM), известные как микроскопия стохастической оптической реконструкции (STORM) и (флуоресцентная) фотоактивируемая микроскопия локализации ((f)PALM) вместе с истощением стимулированной эмиссии живых клеток (STED) [14] для изображения молекулярных молекул. организацию и отслеживание одиночных молекул в плазматической мембране клеток-хозяев IAV [15–17].

Мы провели количественный анализ пространственной организации AF IAV, а также EGFR на поверхности альвеолярных эпителиальных клеток человека. Мы обнаружили, что AF организованы в кластеры размером с вирус с градиентом плотности, который уменьшается от плотного центрального ядра к периферии. Используя их экспериментально определенные характеристики, мы использовали моделирование для изучения их роли во взаимодействиях вирус-клетка. Эти модели хорошо согласуются с экспериментами по отслеживанию вирусов на живых клетках, и вместе они предполагают, что пространственная организация AF в значительной степени влияет на взаимодействие вируса с клеткой на ранней стадии вирусной инфекции.Далее мы показываем, что нанодомены AF неслучайно перекрываются с кластерами EGFR, тем самым способствуя AF-опосредованной активации EGFR. Интересно, что наши результаты также предполагают, что ранее существовавшие кластеры EGFR ответственны за активацию рецептора, опосредованную IAV. Мы представляем новый взгляд на начальные события инфекции вируса гриппа и предлагаем новый взгляд на функциональную роль пространственной организации АФ и рецепторов клеточной поверхности.

Результаты

Факторы прикрепления IAV, содержащие сиаловую кислоту, организованы в нанодомены на плазматической мембране клеток A549

Чтобы изучить пространственную организацию IAV AF внутри плазматической мембраны пермиссивных эпителиальных клеток, мы попытались селективно пометить фрагменты сиаловой кислоты, которые предпочтительно распознаются патогенными для человека IAV, такими как h4N2/X31 [4], используемые здесь.Для этой цели мы использовали растительный лектин Sambuccus nigra агглютинин (SNA), который метит α-2,6-связанный SA, в качестве первичной метки IAV AF (S1 Text, S1 Fig). Используя конфокальную микроскопию, мы обнаружили, что SNA сильно маркирует плазматическую мембрану живых клеток A549 (рис. 1B), демонстрируя неоднородное окрашивание и обогащение пальцеобразными выступами, которые морфологически представляют собой микроворсинки. Затем мы использовали микроскопию STED для более тщательного изучения более гладких областей плазматической мембраны между микроворсинками.На живых клетках A549 мы обнаружили сильную гетерогенность маркировки поверхности клеток SNA, включая небольшие кластеры в масштабе 100–200 нм (рис. 1C, правая панель, вставка).

Наша следующая цель состояла в том, чтобы исследовать латеральную организацию IAV AF в масштабе интерфейса вирус-клетка в фиксированных клетках, чтобы избежать размытия движения. Сначала мы подтвердили, что наш протокол фиксации клеток успешно иммобилизовал молекулы плазматической мембраны (рис. S2), затем параллельно выполнили STORM и STED для изображения плазматической мембраны в масштабе небольших сферических вирионов h4N2/X31 (средний диаметр 120 нм [2]). .STORM (рис. 1D) и STED (рис. S3A) изображения фиксированных клеток A549 подтвердили наши наблюдения, сделанные на живых клетках, о том, что SNA окрашивает множество небольших наноструктур на плоских частях плазматической мембраны. Мы также обнаружили подобное распределение на клетках MDCK, которые очень восприимчивы к IAV (рис. S3B). В качестве SNA-независимого контроля мы использовали агглютинин зародышей пшеницы (АЗП), общий SA-связывающий лектин. WGA пометил клетки A549 с более высокой плотностью, снова выделив микроворсинки и наноразмерные кластеры (рис. S3C).Наконец, мы пометили клетки, используя антитела против эзрина, актин-связывающего белка. Эзрин сильно обогащен микроворсинками [18], что подтвердило, что большие пальцевидные структуры действительно являются микроворсинками (рис. S4A). Поскольку микроворсинки не принимают активного участия в эндоцитозе [19,20], мы сосредоточились на популяции более мелких кластеров АЖ.

Количественный анализ нанодоменов SNA

Для количественной оценки латеральной организации ФП по нашим данным локализации STORM мы использовали алгоритм, основанный на обнаружении различий в локальной плотности.Чтобы облегчить анализ, мы разработали рабочий процесс (см. «Методы»), который позволил нам извлечь геометрические свойства кластеров, а также оценить количество молекул AF (рис. 2A–2C). Чтобы идентифицировать и исключить большую популяцию кластеров микроворсинок, мы сначала выполнили идентификацию кластеров на картах локализации эзрина (рис. S4B). Мы обнаружили, что большие кластеры эзрина имели размеры 10–50 нм по короткой и 0,5–2 мкм по длинной оси (рис. S4B). Затем эти параметры использовались для фильтрации большой популяции кластеров, соответствующих микроворсинкам, идентифицированным на картах локализации SNA (рис. 2C).После фильтрации мы идентифицировали гетерогенную популяцию небольших кластеров со средней площадью 0,016 мкм 2 (рис. 2D). Поскольку площадь кластера была в том же масштабе, что и проекционная двумерная площадь сферического ВАВ (0,0079 мкм 2 для r = 50 нм), мы более внимательно рассмотрели плотность молекул внутри каждого кластера. Чтобы определить локальную плотность, мы подсчитали количество локализаций ближайших соседей на расстоянии, в три раза превышающем точность локализации (3σ ~ 30 нм) (рис. S5).Интересно, что мы обнаружили, что кластеры AF имеют в среднем 10-кратное обогащение по сравнению с локальным фоном, а некоторые достигают даже 20-кратного увеличения (рис. 2E и 2F). В качестве контроля мы использовали моделирование, чтобы проверить влияние точности локализации на локальную концентрацию; однако это объясняет не более чем 8-кратное обогащение (S6D Fig).

Рис. 2. Анализ локализации на основе плотности показывает небольшие кластеры SA между микроворсинками.

( A ) Пространственное распределение локализаций STORM от SNA-A647 на клетках A549, показывающее сосуществование двух структурных особенностей: (1) больших микроворсинок, а также (2) небольших нанодоменов.На вставке A показана реконструкция изображения в пикселях (10 нм/пиксель) карты локализации в A . ( B) Распределение плотности локализаций, показанных в A в радиусе поиска 50 нм. Цветовая шкала по количеству соседних локализаций. ( C ) Окончательный результат кластеризации с идентифицированными кластерами позволяет количественно определить площадь кластера. После того, как все идентифицированные кластеры были отфильтрованы в соответствии с их размером для выборочного анализа структур, не содержащих микроворсинок, мы обнаружили кластеры с площадью от 0.005–0,04 мкм 2 ( D ). Большой кластер, отмеченный красной пунктирной линией, был отфильтрован (см. также S4 Fig). Распределение количества молекул на кластер, оцененное по количеству локализаций ( D , вставка). Внутреннюю структуру скоплений немикроворсинок анализировали в соответствии с плотностью их локальной локализации ( B ). ( E ) Типичный пример двух идентифицированных скоплений, показывающих их внутренний градиент плотности. Цветовой код представляет количество локализаций ближайших соседей в радиусе 30 нм (т.е. локальная плотность локализации). Плотность локализации отложена по вертикальной оси. Распределение разницы плотностей между фоном и центром скопления по всем идентифицированным скоплениям ( F ).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.g002

После идентификации доменов AF мы хотели понять, будет ли их наблюдаемая организация влиять на связывание вируса по сравнению с однородным распределением. Мы построили симуляцию связывания вируса, в которой мы постепенно перераспределяем молекулы AF из случайной в кластерную организацию, сохраняя общее количество молекул постоянным.Параллельно моделировали стабильную популяцию кластеров на фоне свободных отдельных молекул и варьировали количество молекул в кластере. В обоих случаях мы моделируем сферическую вирусную частицу и проецируем ее размер как точку приземления на поверхность моделируемой молекулы. Связывание считается успешным, если вирус контактирует не менее чем с 10 молекулами AF. Как показано на рис. S7, мы обнаруживаем положительную корреляцию между кластеризацией AF и связыванием вируса, что указывает на то, что нанокластеризация повышает вероятность эффективной адгезии вируса.

Отслеживание одиночного ВПВ указывает на исследовательское движение, на которое влияет локальная концентрация АФ

Мы задались вопросом, как движение IAV на клеточной мембране зависит от кластеризации AF. Для разработки гипотезы и специального анализа мы сначала создали простую модель диффузии для имитации поведения отдельных вирусов на плоской части клеточной поверхности. Модель предполагает двумерное случайное блуждание [21], когда вирус подвергается периодам свободной диффузии (с коэффициентом диффузии D свободной ) до тех пор, пока не встретит область с высокой концентрацией AF и не станет временно ограниченным (с коэффициентом диффузии D конф. ).Время, в течение которого смоделированная частица остается ограниченной, будет зависеть от D conf и размера ограниченной области (т. е. размера кластера AF, измеренного с помощью STORM). Для идентификации и количественной оценки ограниченных областей мы использовали ранее опубликованную вероятность удержания I conf , обозначающую вероятность удержания частицы в момент времени t [22]. Несмотря на то, что даже моделирование свободной диффузии показало периоды кажущегося ограничения, из-за стохастической природы теплового движения (рис. S8A), моделирование выявило различные характеристики свободной диффузии (рис. 3A и 3D) по сравнению с ограниченной диффузией. (Фиг.3B и 3E, S8 Fig и S1 Movie).Наконец, мы определили пороговый уровень удержания, I порог = 5 , чтобы исключить эти случайные колебания и определить ограниченные области и время пребывания в заключении (рис. 3A и 3D; рис. S8).

Рис. 3. IAV совершает случайное блуждание по плазматической мембране в зависимости от концентрации рецепторов.

Основываясь на нашем количественном анализе распределения AF на клетках A549, мы выдвигаем гипотезу о движении, которое обусловлено локальной концентрацией AF.Сначала мы моделируем это поведение как двумерное случайное блуждание с коэффициентом свободной диффузии D free ( A ). ( B ) Затем мы моделируем кластеры AF (красные кружки, r = 100 нм), которые из-за повышенной концентрации SA привели бы к временному ограничению (D conf < D free ). Чтобы идентифицировать ограниченные области в смоделированных траекториях вируса, мы устанавливаем вероятность локализации I conf . Соответственно, свободно диффундирующая частица показывает только флуктуацию I conf ( D ), в то время как добавление временного ограничения приводит к явному увеличению, которое перекрывается со стационарными фазами частицы, как видно на графике смещения XY ( E ).Мы использовали вероятность конфайнмента для анализа траекторий экспериментальных вирусов, в частности траекторий смешанного типа ( C ) (см. также S8 Fig) ( C ). I conf показывает четкую сигнатуру временного ограничения ( F ), аналогичную предсказанию модели ( E ). В качестве дополнительной задачи для нашей модели мы выполнили анализ субтраекторий, тем самым извлекая время пребывания, D conf , а также область соответствующего временного ограничения в наших траекториях вируса.( G ) показывает наложение периметров извлеченных замкнутых областей, а также средний радиус (R). Из наших смоделированных данных корреляция D conf со временем пребывания показывает, что локальное увеличение концентрации AF (т.е. снижение диффузии) из-за встречи с нанодоменом SA приводит к увеличению локального времени пребывания ( H , красные маркеры). ). Мы наблюдали подобное поведение, когда проверяли время удержания в экспериментальных траекториях вируса ( H , черные маркеры).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.g003

Чтобы проверить, согласуется ли наша модель с движением IAV, мы выполнили отслеживание одного вируса на живых клетках A549. Мы рассматривали физиологические условия (37°С), а также условия, подавляющие эндоцитоз вируса (4°С, обработка диназором), для увеличения времени пребывания частиц на поверхности клетки. Анализ траектории выявил различные режимы движения, которые мы разделили на четыре типа: (1) ограниченный, (2) баллистический, (3) дрейфующий и (4) смешанный (S8 Fig).Баллистическое движение направленное, со скоростями до 1–2 мкм/сек; таким образом, мы отнесли его к транспорту, связанному с микротрубочками, как описано ранее [6,7]. Поскольку этот тип движения следует за успешной интернализацией вируса, мы ожидали, что его частота уменьшится после блокирования эндоцитоза. Действительно, доля баллистических траекторий упала с 30% до менее 5%, когда мы получали изображения при низкой температуре или в присутствии 40 мкМ dynasore [23]. Интересно, что мы наблюдали заметное увеличение трех других классов движений, предполагая, что они происходят на плазматической мембране (S9 Fig).Когда мы затем более внимательно рассмотрели смешанный класс траекторий, мы обнаружили области длительного времени пребывания IAV, указывающие на пространственное ограничение, чередующееся со свободной диффузией (рис. 3C). Следовательно, мы применили наш анализ ограничения к смешанному классу траекторий IAV, который выявил области выраженного ограничения, которые действительно чередовались с областями свободной диффузии (рис. 3F).

Если домены AF с различной латеральной концентрацией сосуществуют в плазматической мембране, как это наблюдается с помощью STORM, эти области могут служить платформами для связывания для диффузии вирусов.Согласно нашей простой диффузионной модели, локальная концентрация АФ доминирует D conf (см. Методы), что, в свою очередь, определяет время пребывания частиц внутри замкнутых областей. Чтобы проверить в экспериментах, действительно ли D conf отрицательно коррелирует со временем пребывания, мы провели субтраекторный анализ, в котором каждая траектория была проверена на удержание в соответствии с I conf . Затем для каждой ограниченной области мы извлекли время пребывания, а также D conf (см. Методы), обнаружив, что они действительно обратно пропорциональны, как и предсказывает наша модель диффузии (рис. 3H).Субтраекторный анализ также позволил нам оценить пространственные размеры замкнутых областей (рис. 3G). Мы нашли средний радиус 104 нм, соответствующий средней площади 0,057 мкм 2 , что лишь немного больше, чем размер кластера SNA, определенный с помощью STORM (рис. 2D). Таким образом, латеральная организация AF, охарактеризованная с помощью STORM, оказывает прогнозируемое влияние на мобильность вируса, что согласуется с данными отслеживания IAV живых клеток.

EGFR организован в виде нанокластеров, которые случайным образом перекрываются с доменами SNA

Как связывание IAV-гликанов приводит к проникновению в клетку? Чтобы изучить наноразмерные пространственные отношения между AFs и функциональными рецепторами, мы сосредоточились на ранее идентифицированном рецепторе IAV EGFR [9,24].Первоначально мы проверили, что наш штамм IAV (h4N2/X31) связывается с EGFR и зависит от него при инфицировании клеток в нашей экспериментальной системе. Мы обнаружили, что около 20% IAV локализовались совместно с EGFR (S10 Fig), и что эффективность инфекции зависела от доступного EGFR плазматической мембраны и могла быть ингибирована ингибиторами EGFR-специфических киназ (S1 Fig, S11 Fig). Затем мы исследовали латеральную организацию EGFR в клетках A549 с использованием флуоресцентно меченных антител против EGFR. В наших экспериментах по заражению клетки предварительно инкубировали с бессывороточной инфекционной средой (30 мин) перед добавлением вирусов, что является обычной процедурой для заражения вирусом гриппа.Чтобы воспроизвести эти условия, мы также провели предварительную инкубацию без сыворотки, прежде чем клетки были зафиксированы и иммуномечены для EGFR.

Используя визуализацию STORM, мы обнаружили, что EGFR присутствует в гораздо более низких концентрациях на клеточной поверхности по сравнению с SA-конъюгированными AF, но, что интересно, также локализован в нанодоменах (рис. 4A). Из-за разреженности маркировки EGFR, что могло привести к ложному появлению белковых кластеров из-за мерцания флуорофора [25], мы разработали адаптированную схему анализа, основанную на фотофизической характеристике флуоресцентного зонда, используемого в наших экспериментах (S12 Fig).

Рис. 4. EGFR организован в нанодомены, которые перекрываются с доменами SNA.

( A ) Клетки A549 метили антителами против EGFR. Визуализация STORM выявила кластерную организацию EGFR. Кластеры имеют средний диаметр 60 нм и содержат около 5–10 молекул ( B ). Масштабная линейка 1 мкм. Вставка: 100 нм. ( C ) Двухцветная STORM-визуализация клеток A549, меченных SNA и антителами против EGFR. На двух панелях справа показано большее увеличение выделенных областей на левой панели.Шкала баров: 500 нм (левая панель), 200 нм (правая панель). Степень колокализации была количественно определена с использованием колокализации на основе координат, где каждая локализация связана со значением колокализации C A . ( D ) Диаграммы распределения C A локализаций SNA при колокализации с (1) SNA, (2) случайным распределением локализаций при равной плотности, как EGFR и (3) EGFR. После IAV-стимуляции (MOI~100) мы обнаружили, что фосфорилированный EGFR (Y1068) также локализован в нанодоменах.Хотя небольшая популяция кластеров, по-видимому, фосфорилируется без стимула, мы наблюдали увеличение популяции активированных кластеров после стимуляции IAV (MOI ~ 100) или EGF (100 нг/мл) ( E , нижняя панель). Чтобы проверить потенциальное перераспределение EGFR, мы рассмотрели всю популяцию после стимуляции. В то время как после стимуляции EGF мы могли наблюдать снижение фракции сгруппированного белка, а также плотности кластеров на площадь, мы не могли обнаружить такое перераспределение белка после стимуляции IAV ( F ).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.g004

После коррекции моргания и идентификации кластеров мы обнаружили, что в отсутствие стимуляции EGF 30–60% молекул EGFR находятся в кластерах, которые чувствительны к препараты, дестабилизирующие актин и липидный рафт (S11E Fig). Кластеры EGFR имели средний диаметр 29 нм и состояли из 6 молекул (рис. 4В), что согласуется с предыдущими оценками с использованием электронной микроскопии [26] и FRET [27]. Поскольку IAV связываются с AF на клеточной поверхности, мы предположили, что SNA и EGFR должны занимать одни и те же области на плазматической мембране, чтобы обеспечить взаимодействие IAV-EGFR.Чтобы проверить эту гипотезу, мы выполнили двухцветную визуализацию STORM (рис. 4C) с использованием клеток A549, совместно помеченных антителами SNA и анти-EGFR. Действительно, мы обнаружили, что кластеры EGFR перекрываются с SNA-мечеными мембранными доменами. Однако, поскольку сиалилированные AF гораздо более распространены, чем EGFR, их колокализация может происходить просто случайно. Чтобы изучить эту возможность, мы проанализировали наши данные с помощью колокализации на основе координат (CBC) [28], которая оценивает пространственную корреляцию двух наборов данных локализации ( i . и . совместная кластеризация), отраженная в параметре колокализации C A . Чтобы контекстуализировать степень колокализации в нашем наборе данных SNA/EGFR, мы провели эксперимент с положительным контролем, используя SNA, конъюгированный с двумя разными флуорофорами (обозначенными SNA/SNA). В качестве отрицательного контроля и для учета различий в плотности молекул для каждого двухцветного поля зрения в SNA/EGFR мы смоделировали случайный набор данных с той же плотностью (обозначенный как SNA/случайный).Наконец, мы определяем локализации с C A >0,3 как колокализованные (аннотированные C A>0,3 ниже) (рис. S13). Как показано на рис. 4D, отрицательный контроль SNA/случайный достигает C A>0,3 = 0,035, базовый уровень учитывает только случайную колокализацию, в то время как экспериментальный положительный контроль SNA/SNA достигает гораздо более высокого значения, C A>0,3 = 0,27. CBC-анализ колокализации SNA/EGFR достиг промежуточного значения, C A>0,3 = 0,17. Эти анализы показывают, что пространственное перекрытие между EGFR и SNA не является полным и, тем не менее, не случайным, что указывает на то, что обе молекулы имеют общую популяцию мембранных компартментов.

Когда заражающий IAV сталкивается с кластером EGFR, мы ожидаем, что EGFR активируется. Таким образом, мы хотели измерить клеточный ответ EGFR на стимуляцию IAV. Примечательно, что для сохранения сигнала на плазматической мембране эндоцитоз замедляли путем стимуляции клеток на льду. Мы использовали антитело, которое распознает фосфорилированный тирозин (Y1068, pEGFR), ранее показано, что он участвует в индуцированной IAV активации EGFR [9]. Интересно, что мы обнаружили фракцию pEGFR в нанодоменах даже в нестимулированных условиях, что указывает на пре- и/или самоактивацию.После стимуляции EGF или IAV мы наблюдали увеличение количества кластеров pEGFR на площадь плазматической мембраны (рис. 5E). Подобно индуцированной IAV стимуляции EGFR, увеличение локальной плотности кластеров было чувствительно к ингибированию киназы EGFR (S14A и S14B Fig).

Рис. 5. Изображение живых клеток со сверхвысоким разрешением показывает долгоживущие кластеры EGFR в клетках A549.

EGFR, связанный с фотоконвертируемым белком mEos3, экспрессировался в клетках A549. Последующая визуализация PALM позволяет изучить распределение EGFR в живых клетках на уровне отдельных белков.В отсутствие какого-либо стимула мы могли обнаружить нанодомены EGFR внутри дорсальной, а также вентральной плазматической мембраны ( A ). Масштабная линейка: левая панель, 1 мкм. На изображении A показана максимальная проекционная карта локализации отдельных молекул, зарегистрированная в течение 10 минут. B показаны два примера кластеров в виде кумулятивного распределения плотности (верхняя панель), а также разброс XY с цветовой шкалой в соответствии со временем обнаружения локализации (нижняя панель).Хотя проекция всей локализации позволяет идентифицировать белковые кластеры, мы можем использовать информацию о времени для дальнейшей оценки времени жизни кластера. Как показано в C , кумулятивный подсчет отдельных локализаций в сгруппированной области дает прямую информацию о минимальном времени жизни кластера. D показывает соответствующее время жизни кластеров EGFR, зарегистрированных как на дорсальной, так и на вентральной стороне клетки в отсутствие какого-либо стимула.

https://дои.org/10.1371/journal.ppat.1008656.g005

Чтобы лучше понять, как связывание IAV приводит к активации EGFR, мы изучили свойства отдельных кластеров EGFR. Ранее предполагалось, что связывание IAV приводит к локальному увеличению концентрации белков EGFR внутри кластеров плазматической мембраны, что в конечном итоге приводит к активации сигнала [9], эффект, который также наблюдался ранее в клетках BHK при стимуляции EGF [29]. Чтобы проверить эту гипотезу, мы пометили нестимулированные, EGF- или IAV-стимулированные клетки с использованием антител против EGFR.После стимуляции EGF мы наблюдали уменьшение популяции сгруппированных молекул, а также количества кластеров на площадь (оба в среднем на 20%) (рис. 4F). Удивительно, но мы не нашли доказательств значительного перераспределения EGFR после стимуляции IAV (рис. 4F). Кроме того, хотя мы наблюдали колокализацию IAV с EGFR и pEGFR (рис. S10), мы не смогли обнаружить влияние на размер кластера или количество молекул на кластер EGFR (рис. S14C).

EGFR образует долгоживущие нанодомены в живых клетках

Поскольку стимуляция IAV не влияла на организацию EGFR, мы предположили, что предварительно сформированные нанокластеры могут быть вовлечены в индуцированную IAV активацию EGFR.Хотя участие IAV предварительно сформированных кластеров EGFR предполагалось ранее [30], оставалось неясным, будет ли время жизни кластеров EGFR в плазматической мембране достаточно продолжительным, чтобы обеспечить этот тип взаимодействия. Чтобы оценить время жизни кластеров EGFR, мы обратились к экспериментам по микроскопии живых клеток с использованием клеток A549, экспрессирующих EGFR, меченных фотоконвертируемым белком mEos3.2 [31]. Мы использовали вариант EGFR, который ранее показал свою полную функциональность в системе экспрессии клеток млекопитающих [32].Фотоактивация только небольшого подмножества молекул EGFR-mEos3.2 позволила нам локализовать отдельные молекулы, которые затем можно отслеживать в последовательных кадрах и обновлять путем дальнейшей фотоактивации (отслеживание одиночных частиц, sptPALM) [33]. Мы выполнили sptPALM на дорсальной, а также вентральной плазматической мембране живых клеток A549 в отсутствие EGF, что привело к картированию диффузии белка высокой плотности (рис. 5). Расчет среднеквадратичного смещения (СКО) в зависимости от времени запаздывания 𝚫 t позволил определить мгновенный коэффициент диффузии D вдоль траектории.Мы обнаружили широкий диапазон коэффициентов диффузии от 1 до 10 90 696 -3 90 697 мкм 90 696 2 90 697 /сек (рис. S15), что указывает на сосуществование подвижных и неподвижных белковых фракций в плазматической мембране. Действительно, после классификации траекторий на основе их коэффициента диффузии D графики MSD против 𝚫 t выявили довольно линейную зависимость для траекторий с D > 0,05 мкм 2 /сек, а для траекторий с D < 0,05 мкм 2 /сек кривая приближалась к максимуму при больших значениях 𝚫t (рис. S15).Эта характерная временная зависимость кривой MSD от 𝚫 t также указывает на подвижные свободно диффундирующие белки, сосуществующие с ограниченными или неподвижными белками EGFR в плазматической мембране.

Затем те же данные были использованы для построения карты всех обнаруженных локализаций, которая выявила неоднородное распределение с белками, сгруппированными в нанодомены (рис. 5А). Используя наш индивидуальный анализ идентификации кластеров (как показано на рис. 2A–2C), мы обнаружили кластеры EGFR диаметром от 30 до 300 нм, что подтверждает организацию EGFR, наблюдаемую в фиксированных клетках (рис. 4A).Кроме того, поскольку клетки были живыми, мы могли использовать обнаружение одиночной молекулы с временным разрешением для количественной оценки временной стабильности кластеров EGFR (рис. 5B). Такой подход использовался ранее для количественной оценки кластеризации полимеразы 2 в живых клетках и получил название PALM с временной корреляцией (tcPALM) [34]. Мы выбрали области, идентифицированные кластеризацией на основе плотности, для выполнения tcPALM (рис. 5B и 5C) и получили распределение времени жизни кластера EGFR со средним значением 140 секунд (рис. 5D, дорсальный).Примечательно, что это время жизни дает только более низкую оценку, поскольку кластер мог существовать до начала сбора данных, а также мог присутствовать после фотообесцвечивания последней молекулы кластера.

Обсуждение

Понимание начальной фазы вирусной инфекции имеет решающее значение для разработки эффективных контрмер, таких как ингибиторы адгезии, которые улавливают вирусные частицы до того, как они смогут вступить в первый контакт вируса с клеткой [35,36]. После связывания сиалилированных АФ на клеточной поверхности IAV должен найти и активировать функциональный рецептор, чтобы проникнуть в клетку-мишень и заразить ее.Хотя эти два шага имеют решающее значение для инфекции IAV, оставалось в значительной степени спекулятивным, как вирусу удается формировать многовалентный клеточный контакт, сохраняя при этом гибкость для исследования плазматической мембраны и взаимодействия с функциональным рецептором. Здесь мы использовали микроскопию сверхвысокого разрешения для изучения организации взаимодействующих с вирусом молекул в масштабе интерфейса вирус-клетка. Мы обнаружили, что гликановые AF и рецепторы организованы в наноразмерные домены и представляют собой модель того, как связывание клеток может трансформироваться в взаимодействие и активацию рецепторов.Наши выводы схематично представлены на рис. 6.

Рис. 6. Модель опосредованного IAV связывания клеток, поиска и активации рецепторов.

Используя количественную визуализацию STORM, мы смогли показать, что SA-конъюгированный IAV AF, а также один функциональный рецептор, EGFR, образуют нанодомены в плазматической мембране клеток A549. В то время как плотные нанодомены AF представляют собой привлекательную мультивалентную связывающую платформу, их разнообразие в локальной концентрации AF предполагает множество различных времен пребывания, в течение которых IAV будет оставаться связанным в этих доменах.Используя отслеживание одного вируса, мы наблюдали смешанное диффузионно-ограниченное движение, которое можно было смоделировать, используя нашу количественную информацию о кластере SA. Эти данные указывают на управляемый концентрацией рецепторов механизм латерального поиска между нанодоменами, обогащенными SA. В конце концов, поскольку домены AF частично перекрываются с EGFR, IAV сталкивается с функциональным рецептором, который может активироваться, чтобы сигнализировать о проникновении в клетку. Наши данные также предполагают, что стабильная популяция предварительно сформированных кластеров EGFR активируется во время стимуляции IAV, что, возможно, способствует эффективной передаче сигнала.Кластеры EGFR стабилизируются липидными рафтами, а также кортикальным актином.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.g006

Из иллюстрации становится ясно, что микроворсинки являются доминирующим топографическим признаком дорсальной стороны клетки. Однако из-за своего диаметра они не участвуют в вирусном эндоцитозе. Таким образом, мы сосредоточили наши усилия на анализе области между микроворсинками и смогли идентифицировать популяцию нанодоменов AF разного размера.Наше моделирование связывания вирусов показало, что такая кластерная организация AF выгодна и положительно коррелирует с эффективностью связывания вируса (рис. S7). Таким образом, гетерогенная кластерная организация может расширить связывающую способность клеточной поверхности и эффективно предоставить вирусной частице диапазон времени связывания для исследования клеточной поверхности, как это было предложено ранее для дендритной клеточно-специфической межклеточной адгезионной молекулы-3-захватывающего не- интегрин (DC-SIGN) [37].Такой способ связывания может быть особенно актуален для вирусов гриппа, которые обладают большой морфологической изменчивостью и спайковым белком с штаммозависимой аффинностью и специфичностью.

Отслеживание одиночных вирусов флуоресцентно-меченых ВГА на клетках-мишенях и внутри них [5–7] показало, что после формирования начального клеточного контакта частицы ВГА исследуют плазматическую мембрану в среднем в течение 6 мин до эндоцитоза [6]. Совсем недавно многоцветная визуализация ВГА вместе с клатрином показала, что этот период важен для индукции клатрин-зависимого эндоцитоза [7].Мы выполнили отслеживание одного вируса в условиях ограниченного эндоцитоза, чтобы ограничить движение вируса к плазматической мембране. В основном мы находили траектории, где случайная диффузия чередуется с периодами пространственного ограничения. Предполагаемые размеры ограниченных областей соответствовали площади, найденной для нанодоменов AF с помощью STORM. Этот результат согласуется с нашей основной гипотезой о том, что на движение плазматической мембраны вируса в значительной степени влияет локальная организация и плотность доступных АФ.Хотя мы не можем исключить, что удержание IAV вызвано другими факторами, такими как механическая ловушка, наши результаты позволяют сформулировать модель того, как кластерная организация AF контролирует связывание вируса с клеткой на ранних стадиях инфекции.

Образовав устойчивое взаимодействие со своей клеткой-хозяином, ВГА проникают в клетку путем эндоцитоза. Было показано, что EGFR активируется во время и способствует проникновению IAV-клеток [9], но то, как IAV взаимодействует с EGFR, оставалось неясным. Мы обнаружили, что EGFR локализуется в кластерах, которые локализуются совместно с нанодоменами AF.Что касается наших результатов и результатов других (обзор недавно в [38]), современный взгляд на плазматическую мембрану предполагает разделение на очень гетерогенные нанодомены с различным происхождением и функцией. Таким образом, колокализация в наномасштабе измеряется как пространственная близость или совместная кластеризация. Наблюдаемое перекрывание между IAV AF и кластерами рецепторов, таким образом, предполагает, что латеральная организация AFs и EGFR основана на сходных, но не идентичных принципах. Важно отметить, что наблюдаемая организация действительно позволяет IAV связывать EGFR при перемещении внутри и между доменами AF (Fig. 6).

В канонической модели активации EGFR связывается со своим субстратом EGF, подвергается димеризации и последующему аутофосфорилированию, тем самым индуцируя различные сигнальные каскады [39]. Однако, как показано здесь на клетках A549, дополнительный уровень более высоких олигомерных кластеров EGFR был показан в разных типах клеток. Их зарегистрированный диаметр колеблется от 50 нм [29] свыше 100–300 нм [26,30,40] до размеров, близких к микрометрам [41], с числом молекул от <10 [42] до тысяч [41].Было высказано предположение, что кластеризация способствует активации рецепторов, которые могут играть роль в развитии опухоли [30]. Кроме того, было показано, что размер кластера EGFR реагирует на активацию [29], что свидетельствует о латеральном перераспределении молекул. Что касается кластерной организации EGFR, мы выдвинули гипотезу о двух сценариях, в которых во время активации EGFR либо (1) собирается в активированные кластеры, либо (2) активируются ранее существовавшие кластеры. Следовательно, мы проверили организацию EGFR в (не)стимулированных условиях.Хотя мы наблюдали уменьшение доли сгруппированных молекул, а также количества кластеров на площадь при стимуляции EGF, эффект, который наблюдался ранее для Erb2 [43], мы не обнаружили значительного перераспределения в ответ на присоединение IAV. Этот результат говорит об активации ранее существовавших кластеров, а также может указывать на другой механизм активации. EGFR связывает EGF с высокой аффинностью (нМ), что приводит к быстрой активации EGFR (в течение 10 мин [44]) и интернализации. IAV связывает EGFR, используя сиалилированные гликаны, процесс с низким сродством, который требует некоторой степени поливалентности.Наши эксперименты по колокализации показали, что IAV также связывают несколько кластеров EGFR (S10 Fig), что указывает на другой механизм рекрутирования/активации. Как IAV затем в конечном итоге активирует EGFR, до сих пор неясно, и это станет целью будущих исследований. Ранее было показано, что IAV-индуцированный эндоцитоз EGFR действительно происходит медленнее по сравнению с EGF-индуцированной активацией, предположительно из-за различного механизма связывания и активации [9]. Используя STORM, мы не смогли обнаружить изменения в размере кластера и составе молекул после любой стимуляции.Отсюда мы заключаем, что межкластерные пространственные перестройки ниже нашего предела разрешения могут в конечном итоге привести к активации кластера. Для проверки этой гипотезы можно использовать методы, более чувствительные к расстояниям между белками менее 20 нм, такие как FRET.

Следуя нашей гипотезе об активации предварительно сформированных кластеров EGFR, мы стремились проверить, существуют ли кластеры EGFR достаточно долго, чтобы обеспечить их активацию. Таким образом, мы продолжили исследование стабильности нанокластеров EGFR, проводя эксперименты sptPALM на живых клетках.Мы обнаружили, что время жизни нанодоменов EGFR как на дорсальной, так и на вентральной стороне клетки увеличилось от 2 до 4 минут. Это время напоминает продолжительность пребывания ВАВ на плазматической мембране до начала эндоцитоза (2–3 мин [7]). В то время как длительное время жизни кластера позволило бы активировать ранее существовавшие кластеры, это наблюдение поднимает вопрос о стабилизации кластеров EGFR. Следовательно, мы проверили стабильность кластеров EGFR при обработке классическими условиями, дестабилизирующими мембранный домен, такими как деполимеризация актина (латрункулин А) и экстракция холестерина (метил-β-циклодекстрин).Как также наблюдалось ранее [29,30], наши результаты предполагают дестабилизацию кластера после обоих возмущений, на что указывает увеличение доли некластеризованных молекул EGFR. Интересно, что мы обнаружили более сильный эффект после истощения запасов холестерина, состояние, которое, как было показано ранее, ослабляет репликацию IAV [9]. Очень длительное время жизни кластера рецепторов наблюдалось ранее для молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I, которые образуют актин-стабилизированные домены [45,46]. На данный момент мы можем только догадываться о функции кластеров мембранных рецепторов [38,47].Он может быть возбуждающим, как показано для Т-клеточного рецептора [48] и линкера для активации Т-клеток (Lat) [49,50], а также LFA-1 [51] или CD36 [52]. Эти нанодомены делают клетку высокочувствительной к малым количествам сигнальных молекул и благодаря высокой локальной концентрации рецепторов обеспечивают быстрый сигнальный ответ [39]. Такая функция кажется вероятной для кластеров EGFR, участвующих в проникновении клеток IAV, наблюдаемых в нашем исследовании. Но их функция также может быть ингибирующей, как показано для рецептора В-клеток [53] или его негативного корецептора CD22 [54].Рецепторные нанодомены могут даже участвовать в модуляции сигнального выхода. Поскольку EGFR находится на вершине широкого спектра сигнальных каскадов, асимметричное распределение рецепторов может позволить клеткам быстро реагировать и обрабатывать различные стимулы [39].

Таким образом, мы идентифицировали сложную компартментализацию клеточной плазматической мембраны в клетках A549 как с первичными молекулами, связывающими IAV, сиалированными AF, так и с функциональными рецепторами, организованными в нанодомены. Такая организация наблюдалась и для других мембранных белков и может указывать на общий принцип организации плазматической мембраны (обзор в [38]).Мы разработали функциональную модель, чтобы связать организацию латеральной мембраны с ее ролью в вирусной инфекции (рис. 6). Количественная микроскопия сверхвысокого разрешения предоставила универсальный набор инструментов для изучения структурно-функциональных отношений плазматической мембраны. Наше исследование представляет собой первый шаг в понимании нанофизиологии вирусной инфекции. Связывая организацию с функционированием интерфейса вирус-клетка, наша цель — лучше понять, как вирусы используют клеточные структуры. То, как компартментализация мембраны может модулировать связывание клеток и рецепторов IAV, как показано здесь, будет дополнено функциональными исследованиями, изучающими задействованную сигнальную активацию в будущем.

Материалы и методы

Заявление об этике

Работа с эмбрионами куриных яиц проводилась в лаборатории проф. Андреаса Херрманна (Институт биологии, Университет им. Гумбольда в Берлине, Германия) в соответствии с европейскими нормами и одобрена Государственным органом Берлина, Landesamt für Gesundheit und Soziales. Грипп A (h4N2) X-31 размножали в аллантоисных полостях 10-дневных куриных яиц с эмбрионами (Lohmann Tierzucht GmbH, Германия), как описано ранее [55].

Клетки и вирусы

клетки A549 (ATCC CCL-185) были любезно предоставлены доктором Торстеном Вольфом (Институт Роберта-Коха, Берлин, Германия). Клетки A549 культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Клетки пассировали каждые 3–4 дня. Клетки не были поляризованы. Мы называем дорсальную и вентральную мембраны верхней поверхностью клетки, а также частью клетки, прикрепленной к субстрату. За сутки до эксперимента клетки отделяли от колбы для культивирования клеток с помощью 0.5% трипсин/ЭДТА в течение примерно 10 мин. Клетки разбавляли свежей DMEM и 3×10 5 клеток высевали на покрытые фибронектином круглые предметные стекла диаметром 25 мм (Menzel, № 1.5). Вирус гриппа А (h4N2) Х-31 размножали в аллантоисных полостях 10-дневных куриных яиц (Lohmann Tierzucht GmbH, Германия), как описано ранее [55]. Очищенные вирусы хранили при -80°С. Аликвоты вируса размораживали в день эксперимента и хранили на льду до дальнейшего использования. Все химикаты, если не указано иное, были приобретены у Sigma-Aldrich.Среды для культивирования клеток были приобретены у Life Technologies. Для лечения NA мы используем нейраминидазу из Clostridium Perfringens (Sigma), которая расщепляет α2,6- и α2,3-связанный SA.

Инфекция клеток А549

За день до эксперимента 3*10 5 клеток высевали на покрытые фибронектином круглые предметные стекла диаметром 25 мм. Для экспериментов по заражению (S1, рис.) клетки инкубировали либо в бессывороточной среде в течение 30 минут (контроль), либо в среде DMEM, дополненной 100 нг/мл EGF человека (R&D Systems) в течение 90 минут, чтобы удалить EGFR с поверхности клеток.Клетки инфицировали IAV X-31 (MOI ~1) в инфекционной среде (DMEM, 0,2% альбумина бычьей сыворотки (BSA)) в течение 30 мин перед заменой среды, после чего клетки инкубировали в течение 8 ч в инфекционной среде. Клетки промывали в предварительно подогретом PBS и фиксировали в свежеприготовленном 4% PFA (Alpha Aesar) в течение 10 мин при комнатной температуре. Мы контролировали, чтобы наш протокол фиксации мог успешно иммобилизовать молекулы плазматической мембраны в клетках A549 (рис. S2, рис. S16). После 25-минутной фиксации/блокировки в PBS с добавлением 0.2% Triton X-100 и 0,2% BSA, клетки инкубировали с первичным антителом (противогриппозный нуклеопротеин (NP), Millipore) в течение 1 часа. Клетки промывали три раза по 10 мин в PBS, а затем инкубировали со вторичными антителами (козьи антимышиные, конъюгат Alexa 555, Life Technologies) в течение 1 часа. Наконец, клетки промывали в PBS, окрашивали DAPI (0,2 мкг/мл в PBS в течение 10 мин) и помещали на стандартные предметные стекла с Mowiol (Carl Roth). Слайды визуализировали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа Zeiss Axioplan.Для каждого состояния было получено десять обзорных изображений (20-кратное увеличение), а сигнал ядерного NP был количественно определен с использованием Cellprofiler [56]. Для колокализации (S10 рис.) и экспериментов по стимуляции клеток (рис. 4, S1A рис., S14 рис.) клетки были инфицированы при MOI = 100. Для получения более подробной информации о создании экспериментальной системы см. текст S1.

Трансфекция клеток А549

За один день до трансфекции 2*10 5 клеток высевали на покрытые фибронектином круглые предметные стекла диаметром 25 мм.Клетки трансфицировали плазмидами, кодирующими EGFR-mEos3.2, с использованием липофектамина 2000 (Life Technologies) в соответствии с рекомендациями производителей. EGFR-mEos3.2 был клонирован из EGFR-GFP, подаренного Александром Соркиным (плазмида Addgene # 32751). Используя наш протокол трансфекции, мы протестировали кластеризацию EGFR на разных уровнях экспрессии. Мы заметили, что плотность кластеров на площадь, но не размер кластеров, зависела от уровня экспрессии (S16 Fig).

Отслеживание отдельных вирусов

IAV h4N2/X-31 инкубировали с 50 мкМ липидного красителя DiD (Life Technologies) в течение 2 ч при комнатной температуре.Для удаления свободного красителя вирусы либо осаждали (50 000 г в течение 5 мин), либо очищали с использованием колонки исключения размера NAP5 (GE Healthcare). DiD-меченые вирусы разводили в инфекционной среде (DMEM, 0,2% BSA) до конечной концентрации 20 мкг/мл (содержание белка) и вирусные агрегаты удаляли с помощью стерильного фильтра 0,2 мкм. Меченые вирусы добавляли к клеткам A549, выращенным в чашках Петри со стеклянным дном диаметром 35 мм, покрытым поли-L-лизином (MatTek Corp.), и оставляли для прикрепления на льду на 10 мин. Клетки промывали PBS и покрывали 2 мл предварительно нагретой, не содержащей сыворотки и фенолового красного DMEM с добавлением 100 мМ Hepes.Если не указано иное, клетки хранили при 4 или 37° на протяжении всего эксперимента. Для экспериментов по возмущению клетки предварительно инкубировали в среде DMEM с добавлением 50 мкМ нокодазола (Sigma) или 40 мкМ диназора (Sigma) в течение 30 мин. Препараты присутствовали на протяжении всего эксперимента. Инкубация при низкой температуре была достигнута с использованием специальной температурной камеры микроскопа. ДиД возбуждали лазерным излучением с длиной волны 633 нм, которое отражалось на образце дихроичным зеркалом с длиной волны 488/633 нм.Свет излучения собирали с помощью иммерсионного объектива PlanApo VC с увеличением 60x (Nikon) и отображали на камеру EMCCD (Andor iXon, Andor Technology). Изображения записывались со скоростью 2 кадра в секунду в течение 10 мин. Стеки изображений обрабатывались, а траектории строились с помощью ParticleTracker для ImageJ [57]. Траектории были дополнительно проанализированы с использованием пользовательских сценариев MatLab (Mathworks). Чтобы определить и охарактеризовать временное удержание частиц, мы использовали метод, разработанный Симсоном и др. .[22] внедрены в наш пользовательский конвейер анализа. Вкратце, алгоритм берет сегмент траектории и определяет, двигалась ли частица в соответствии с заданным коэффициентом свободной диффузии ( D свободно ) в пределах сегмента, то есть остаются ли частицы в предсказанной области. Это переводится в вероятность локализации I conf . Поскольку идентификация зависит от длины сегмента S [22], мы оптимизировали S, используя смоделированные траектории, в результате чего S = 5 с для нашего анализа.

Анализ траекторий и моделирование отслеживания отдельных частиц

Случайные траектории броуновских частиц были сгенерированы с использованием пакета сценариев msdanalzer [58], включенного в пользовательскую программу MatLab. Одиночные вирусные траектории анализировали, как описано выше. Анализ траекторий и субтраекторий был выполнен с использованием msdanalzer для извлечения коэффициентов диффузии из графиков среднеквадратичного смещения (MSD, 2 >) в зависимости от времени запаздывания (Δt).Графики СКО в зависимости от времени запаздывания были подобраны в соответствии с типом двигательного поведения, которое представляло собой либо свободную диффузию ( 2 > = 4D свободное Δt), либо, для субтраекторного анализа, ограниченную (суб)диффузию ( 2 > = 2 > (1-A 1 exp (−4A 2 D conf Δt/)). Для ИАВ найден средний коэффициент свободной диффузии D свободный = 0,041 мкм 2

Используя D бесплатно , а также временной шаг (Δt = 0.5 с) смещение свободно диффундирующей частицы следует распределению Гаусса со стандартным отклонением, определяемым как σ = sqrt(4D free Δt). Временное ограничение было введено путем создания подтраектории с использованием D conf . Для моделирования времени пребывания мы сгенерировали случайные траектории, которые входят в область удержания, характеризуемую D conf , с диаметром 50–300 нм в соответствии с размером кластеров SNA из измерений STORM (S1 Movie). Ограниченные области были идентифицированы с использованием вероятности удержания I conf , а время, которое частица проводит в ограничении с I conf > порога, было взято в качестве времени пребывания.D conf был изменен, как показано на рис. 2.

Получение меченых лектинов и антител

Неконъюгированный агглютинин Sambuccus nigra (SNA, VectorLabs) или антитела против EGFR (Sigma) разводили до 0,6 мг/мл в 100 мкл PBS (с добавлением 50 мМ NaHCO 3 ). Добавляли сложный эфир AlexaFluor 647 NHS (Life Technologies) или сложный эфир Star Red NHS (Abberior) в конечной концентрации (150 мкМ) и раствор инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре.Добавляли 100 мкл PBS и раствор наносили на колонку для исключения размера NAP5 (GE Healthcare), предварительно уравновешенную PBS. Фракции по 300 мкл собирали в 96-луночный планшет и анализировали с помощью спектроскопии в ультрафиолетовой и видимой областях (Nanodrop2000, ThermoFisher). Собирали пиковые белковые фракции и рассчитывали степень мечения. Меченые фракции лектина и антитела хранили при 4°С до дальнейшего использования.

Подготовка проб SMLM

За день до эксперимента 3*10 5 клеток A549 высевали на покрытые фибронектином круглые предметные стекла диаметром 25 мм.Для визуализации SNA клетки промывали в предварительно нагретом PBS и фиксировали в течение 10 мин в свежеприготовленном 4% параформальдегиде (Alpha Aesar). Клетки блокировали блокирующим раствором (5% BSA в PBS) и инкубировали в 50 мкг/мл SNA, разведенного блокирующим буфером, в течение 30 мин. Клетки промывали 3 раза в PBS и постфиксировали в свежеприготовленном 4% параформальдегиде в течение 10 мин при комнатной температуре. Для мечения EGFR клетки промывали, фиксировали и блокировали, как описано выше, затем инкубировали с первичными антителами против EGFR, конъюгированными с Alexa 647.Для двухцветной визуализации клетки инкубировали с неконъюгированными первичными антителами против EGFR в течение 1 часа при комнатной температуре. Клетки трижды промывали в PBS и далее инкубировали с раствором 5 мкг/мл вторичных антител, конъюгированных с Alexa 750 (козьи антимышиные, Life Technologies), и 5 мкг/мл SNA, конъюгированных с Alexa 647. Клетки промывали 3 раза в PBS и постфиксировали в свежеприготовленном 4% параформальдегиде в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки A549 на рис. 1B были помечены 10 нг/мл SNA-Alexa647 и 1 мкг/мл Hoechst33342 (Life Technologies) в среде DMEM.

SMLM-микроскопия

EGFR одно- и двухцветные изображения STORM были выполнены с использованием недавно разработанного плоскопольного микроскопа для эпи-освещения [59]. Вкратце, для выключения флуорофоров использовали два лазера с длинами волн 642 нм (2РУ-ВФЛ-П-2000-642-Б1Р, MPB Communications) и 750 нм (2РУ-ВФЛ-П-500-750-Б1Р, MPB Communications). на образце, в то время как лазер 405 нм (OBIS, Coherent) контролировал скорость возврата флуорофоров в излучающее флуоресценцию состояние. Пользовательский дихроик (ZT405/561/642/750/850rpc, Chroma) отражал лазерный свет и пропускал флуоресцентное излучение до и после прохождения через объектив (CFI60 PlanApo Lambda Å~60/NA 1.4, Никон). После прохождения соответствующего фильтра (ET700/75M, Chroma или ET810/90m, Chroma) испускаемый образцом свет отображался на sCMOS-камеру (Zyla 4.2, Andor). Осевое положение образца контролировали с помощью открытого аппаратного модуля автофокусировки pgFocus (http://big.umassmed.edu/wiki/index.php/PgFocus). Обычно с помощью Micromanager[60] записывалось 20 000 кадров с выдержкой 10 мс. Визуализация выполнялась с использованием оптимизированного буфера STORM, как описано ранее [61]. Стеки изображений были проанализированы с использованием специальной процедуры анализа, адаптированной к CMOS [62].Боковое смещение образца было скорректировано с помощью корреляции изображений (Thunderstorm [63]) или золотых реперных маркеров (B-Store, https://github.com/kmdouglass/bstore). Двухцветные наборы данных были проанализированы с использованием LAMA [64]. Случайные наборы данных для анализа CBC были сгенерированы в MatLab.

Одноцветное изображение

SNA выполняли на модифицированном инвертированном микроскопе Olympus IX71. Лазер с длиной волны 641 нм (Coherent, CUBE 640-100C) и лазер с длиной волны 405 нм (Coherent, CUBE 405-100C) отражались многополосным дихроиком (89100 пс, Chroma) на задней апертуре 100×1.Масляный объектив 3 NA (Olympus, UplanFL), установленный на сканере с пьезообъективом (P-725 PIFOC, Physik Instrumente). Собранную флуоресценцию фильтровали с помощью полосового эмиссионного фильтра (ET700/75, Chroma) и отображали на камеру EMCCD (IxonEM+, Andor) с размером пикселя 100 нм и с использованием обычного ПЗС-усилителя при частоте кадров 25 кадров в секунду. Интенсивность лазерного излучения на образце, измеренная после объектива, составляла 2–4 кВт/см 2 . С помощью Micromanager[60] было записано 20 000 кадров с выдержкой 30 мс.Стеки изображений были проанализированы с помощью ThunderStorm[63]. Боковой дрейф образца был скорректирован либо с помощью корреляции изображения (Thunderstorm [63]), либо с помощью золотых реперных маркеров (PeakSelektor, IDL, любезно предоставлено Harald Hess).

Визуализация

PALM была выполнена на инвертированном микроскопе Zeiss Axio Observer D1, оснащенном объективом 100x с числовой апертурой 1,49 (Zeiss). Лазеры активации и возбуждения с длиной волны 405 нм (когерентный куб) и 561 нм (кристаллический лазер) освещали образец в режиме полной внутренней флуоресценции (TIRF).Мы использовали четырехцветный дихроик 89100bs (Chroma), флуоресцентное излучение отфильтровывали эмиссионным фильтром ET605/70 (Chroma) и регистрировали с помощью ПЗС-камеры с электронным умножением (iXon+, Andor Technology) с результирующим размером пикселя 160 нм. Для каждой интересующей области обычно собирали 10000 изображений области 41×41 мкм2 с временем экспозиции 30 мс. Фотоактивируемые белки активировали лазером с интенсивностью 405 нм <0,5 Вт/см 2 , выбранным для поддержания разреженной популяции активированных молекул для локализации, и возбуждали лазером с интенсивностью 561 нм мощностью ~ 1 кВт/см 2 .Стеки изображений были проанализированы с помощью ThunderStorm[63].

STED-микроскопия

Измерения STED

живых клеток были выполнены с помощью микроскопа Abberior STED (Abberior Instruments, Германия), как описано ранее в [65,66]. Микроскоп оснащен титано-сапфировым лазером STED (MaiTai HP, Spectra-Newport). SNA, меченый Abberior Star Red, возбуждали импульсным диодным лазером с длиной волны 640 нм (Picoquant, Германия) со средней мощностью возбуждения на объективе 5–10 мкВт (UPlanSApo 100x/1.4 масло, Олимп). Истощение было достигнуто с помощью перестраиваемого импульсного лазера на 780 нм. Микроскоп работал с использованием программного обеспечения Abberior Imspector. Измерения STED с фиксированными ячейками (рис. S3) выполняли на STED-микроскопе Leica SP8. Микроскоп был оснащен объективом HC PL APO 100x, лазером белого света для возбуждения и лазером истощения с длиной волны 592 нм.

Кластерный анализ

Для кластерного анализа мы использовали алгоритм пространственной кластеризации на основе плотности с шумом (DBSCAN) [67], который был встроен в нашу пользовательскую программу анализа MatLab.DBSCAN требуется только два входных параметра: Eps и k . Затем для каждой локализации подсчитывается, сколько соседних локализаций находится в пределах круга радиусом Eps . Если локализация имеет тыс. соседей в пределах Eps , она классифицируется как часть кластера. Если у него недостаточно соседей в пределах Eps , но он сам является соседом локализации кластера, он классифицируется как граничная точка. Все остальные локализации классифицируются как некластеризованные.Чтобы проанализировать очень плотные и неоднородные карты локализации, которые мы получили из изображений SNA, мы выполнили два последовательных запуска DBSCAN с разными параметрами для Eps и k . Только это позволило учесть все визуально видимые кластеры. Затем сгруппированные и граничные точки объединяются и передаются в часть процедуры анализа с одним кластерным анализом. Для каждого кластера мы исследовали набор параметров, таких как площадь и средний диаметр, а также количество локализаций на кластер.Далее мы проанализировали распределение плотности локализации на кластер, выполнив поиск ближайшего соседа с радиусом поиска 20 нм. Вся обработка локализации выполнялась с использованием специально написанных скриптов MatLab (MathWorks).

Калибровка одной молекулы

Чтобы измерить точность локализации нашей системы и откалибровать параметры группировки, мы выполнили визуализацию STORM на изолированных молекулах красителя. Круглые предметные стекла диаметром 25 мм (Menzel, № 1.5) подвергали плазменной очистке в течение 10 минут и покрывали раствором поли-L-лизина (100 мкг/мл в ddH 2 O) в течение 1 часа при комнатной температуре.После промывания в ddH 2 O предметные стекла высушивали и инкубировали с 10–50 пМ SNA, конъюгированными с красителем, или антителами против EGFR соответственно. Через 15 минут слайды промывали один раз, а затем визуализировали в экспериментальных условиях. Карты локализации были отфильтрованы и скорректированы с помощью золотых реперных точек. Индивидуальные локализации были сначала сгруппированы с интервалом 90 688 = 0  и радиусом поиска 30 нм для объединения отдельных событий моргания, а затем снова сгруппированы с интервалом времени, равным общему времени сбора данных (15 000 кадров).Это позволяет количественно определить разброс локализаций по x и y 𝜟(x , y) (т.е. точность локализации σ), а также время между отдельными миганиями (т.е. темное время t D ). Вся обработка локализации выполнялась с использованием специально написанных скриптов MatLab (MathWorks).

Моделирование связывания вирусов

Мы моделировали плоский участок клеточной поверхности (1×1 мкм 2 ), включающий n молекул фактора прикрепления в случайных положениях.Для анализа степени кластеризации (рис. S7B) смоделированные молекулы постепенно сдвигались в кластеры, в то время как n сохранялось постоянным. Чтобы проанализировать влияние размера кластера (то есть количества рецепторов на кластер), мы смоделировали постоянную концентрацию молекул фактора прикрепления и добавили кластеры рецепторов указанного размера (рис. S7A). Вирус, пытающийся прикрепиться, моделировался как двумерная проекция сферической вирусной частицы размером 100 нм. Вирусный центр случайным образом помещали на моделируемую поверхность и подсчитывали количество молекул фактора прикрепления в радиусе 50 нм.Более 10 молекул считали успешным связыванием. Скрипты Matlab для запуска симуляции доступны на GitHub (https://github.com/christian-7/Virus_Binding_Simulation).

Вспомогательная информация

S1 Рис. Создание экспериментальной системы.

Сначала мы проверили, подходит ли наша экспериментальная система (вирус и клетки) для намеченных экспериментов. Связывание вируса тестировали при высоком MOI после низкотемпературной адсорбции с последующим иммуноокрашиванием с использованием антисыворотки против h4N2.Мы обнаружили, что наш штамм IAV может эффективно связываться с клетками A549 при высоком MOI (~ 100) ( A ). Отдельные ячейки выделены (пунктирные линии). Инфекцию IAV проводили при более низком MOI (~ 1), чтобы добиться высококонтрастной инфекции и избежать гиперинфекции. После инфицирования клетки инкубировали в течение 8 часов, затем фиксировали и окрашивали с помощью иммуноокрашивания с использованием антител против NP. Инфекцию количественно определяли как накопление ядерных NP и анализировали с помощью CellProfiler [56] (соотношение NP/DAPI) ( B ). Мы обнаружили, что наш вирус гриппа A h4N2/X31 может эффективно инфицировать клетки A549 при титре 8.3*10 5 фокусообразующих единиц (ФОЕ) на мл. Клетки A549 обрабатывали либо 100 нг/мл EGF в течение 30 минут для снижения концентрации доступных рецепторов EGF на клеточной поверхности, либо 0,01 ЕД/мл нейраминидазой в течение 3 часов при 37°C. Клетки инфицировали гриппом A/X31 (MOI ~ 1) в течение 8 часов, затем фиксировали и метили для вновь продуцируемого вирусного нуклеопротеина (NP) ( D ). Ядра клеток докрашивали DAPI. Сигнал ядерного NP количественно определяли с помощью автоматизированного анализа изображений с помощью CellProfiler (E, F).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s002

(PDF)

S2 Рис. EGFR иммобилизован после химической фиксации.

Клетки A549 трансфицировали плазмидами, кодирующими EGFR-mEos3.2, за 24 часа до визуализации. В день эксперимента среду для выращивания DMEM заменяли на среду Лейбовица, клетки переносили в держатель образца микроскопа и визуализировали с использованием освещения TIRF в течение 10 минут на поле зрения. Отдельные белки EGFR могут быть локализованы и отслежены на нескольких кадрах. показывает визуализацию всех локализаций с одного поля зрения. B показаны траектории трех молекул EGFR вокруг нанокластера (выделенная рамками A ). Мы обнаружили фракцию неподвижного белка около 45%. После фиксации PFA подвижность EGFR сильно уменьшилась, что привело к образованию меньших кластеров ( C, визуализированное изображение; D , траектории в прямоугольнике) и доле неподвижного белка >95% ( E ). Чтобы связать количество иммобилизации, мы также отследили локализацию, связанную с золотыми реперными точками, иммобилизованными на предметном стекле (Bkgd в E ).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s003

(PDF)

S3 Рис. Наноорганизация гликанов в клетках A549.

Клетки A549 фиксировали, метили с помощью SNA и визуализировали с помощью STED. Мы обнаружили аналогичную организацию гликанов в виде небольших кластеров, а также выступающих микроворсинок, визуализированных с помощью STORM ( A ). Подобная организация гликанов наблюдалась с использованием SNA на клетках MDCK ( B ). Мы также пометили клетки A549 агглютинином зародышей пшеницы (WGA), который, в отличие от SNA, менее специфично метит все сиалилированные гликаны ( C ).Используя WGA, мы смогли воспроизвести компартментализацию нанокластеров клеточной поверхности, а также выступающие полые микроворсинки (стрелки на C , правая панель).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s004

(PDF)

S4 Рис. Наноразмерная организация эзрина в клетках A549. Клетки

( A ) A549 были иммуномечены актин-связывающим белком Ezrin, который, как было показано, обогащен микроворсинками [18]. Клетки визуализировали с помощью STORM.Микроворсинки четко различимы и напоминают большую кластерную популяцию, наблюдаемую на SNA-меченых клетках и при сканирующей электронной микроскопии (SEM, вставка). Шкала баров: левая панель: 2 мкм, правая панель: 500 нм, вставка: 200 нм. ( B ) Затем карты локализации эзрина можно использовать для установки порогового значения размера кластеров, полученного из кластеризации DBSCAN, для специального анализа популяции кластеров без микроворсинок на картах локализации SNA (рис. 2).

https://doi.org/10.1371/journal.стр.1008656.s005

(PDF)

S5 Рис. Экспериментально полученная точность локализации σ для Alexa 647 и Alexa 750.

Предметные стекла промывали, очищали плазмой и покрывали поли-L-лизином (0,01% в воде) на 1 час. Конъюгированные антитела разводили в PBS до конечной концентрации ~10 нМ и адсорбировали на предметные стекла с покрытием. Отдельные молекулы были изображены в экспериментальных условиях. Локализации, происходящие от отдельных молекул Alexa 647 ( A ) и Alexa 750 ( B ), были выровнены, чтобы можно было оценить среднюю точность локализации: σ x, y A647 = 12 нм и σ x, y A750 = 21 нм.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s006

(PDF)

S6 Рис. Точность локализации частично имитирует локальный градиент концентрации.

Чтобы проверить, объясняет ли точность локализации градиент плотности локализации, который мы наблюдали в кластерах AF (рис. 3), мы смоделировали кластеры со случайными локализациями ( A ), используя данные о размере кластера, взятые из наших экспериментальных измерений STORM (т.е. радиус ). r , количество локализаций n , точность локализации σ ).Затем была определена локальная плотность с использованием поиска ближайшего соседа в радиусе 3 σ . Мы действительно наблюдали, что смоделированные кластеры демонстрируют локальное обогащение примерно до 8 раз (см. один пример в A C ). Затем мы смоделировали кластеры, следуя полному распределению экспериментальных данных (т.е. радиус х , количество локализаций х ). Сравнивая с градиентом плотности, наблюдаемым в наших экспериментальных данных ( D и рис. 3), мы обнаруживаем, что оба распределения хорошо разделены и что описанный эффект объясняет только изменения плотности <8 раз.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s007

(PDF)

S7 Рис. Кластерная организация AF увеличивает вероятность связывания IAV.

Чтобы оценить влияние кластеризации AF на эффективность связывания вируса с клеткой-мишенью, мы смоделировали два сценария в области мембраны 1×1 мкм: ( A ) разный размер кластера и ( B ) разную степень кластеризации. Для A мы смоделировали постоянную латеральную концентрацию AF (черный цвет) и добавили кластеры AF (синий цвет) с увеличением размера.В B мы сохраняем общее количество AF постоянным и постепенно сдвигаем молекулы в кластеры. В обоих случаях приближающийся вирус моделировался как 2D-проекция небольшой сферической частицы IAV (площадь контакта в виде красных кругов на A и B ). Попытка связывания считалась успешной, если в области контакта обнаруживалось не менее 10 молекул АФ. C и D показывают результат моделирования, нанесенный на график как вероятность связывания из 1000 симуляций в зависимости от соответствующего тестируемого параметра кластера.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s008

(PDF)

S8 Рис. Вероятность удержания может надежно идентифицировать переходную иммобилизацию в траекториях IAV.

Чтобы проверить точность вероятности удержания, мы смоделировали случайные траектории, которые не содержали или не содержали ограниченную область, и рассчитали вероятность удержания I conf для каждой траектории. Ограниченная область была выбрана в соответствии с экспериментальными данными для радиуса (r = 50–300 нм), а также D conf (рис. 2 и 3).Чтобы идентифицировать ограниченную область, нам пришлось установить порог I conf , который мы установили на 5, чтобы обеспечить высокую чувствительность. Наши симуляции (100 траекторий) показывают, что при этом пороге у нас есть вероятность ложной идентификации (ложных срабатываний) ~10%, которая падает до 0% при I conf > 8 ( A ). Для симуляций, которые содержали ограничение (пример в B ), мы обнаружили среднюю эффективность обнаружения (истинные срабатывания) 90% по всему пространству симуляции (900 траекторий, цветовой код в C ).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s009

(PDF)

S9 Рис. Отслеживание одиночного вируса IAV на клетках A549.

Отслеживание одиночного вируса на живых клетках A549 выявило четыре основных типа перемещения вируса: ( A ) трехстадийное перемещение, ( B ) замкнутое, ( C ) смешанное, ( D ) дрейфовое. Фракция всех режимов движения была проанализирована в указанных условиях ( E ).

https://doi.org/10.1371/journal.стр.1008656.s010

(PDF)

S10 Рис. IAV совместно локализуются с EGFR и pEGFR на клетках A549.

Клетки A549 инфицировали IAV X31 (MOI = 100) при низкой температуре в течение 15 минут, затем фиксировали и подвергали иммуноокрашиванию с использованием антисыворотки против h4N2 вместе с антителами против EGFR или против pEGFR (Y1068). Мы проанализировали снимки в широкопольном эпи-освещении ( A ), а также в двухцветном STORM ( B ). Используя широкопольное эпи-освещение, мы наблюдали яркие пятна IAV, которые локализовались совместно с кластерами EGFR и сигналом pEGFR (указатели стрелок).Масштабная линейка = 2 мкм. Мы количественно оценили эту колокализацию и обнаружили, что в обоих случаях около 20% IAV совместно локализуются с EGFR и pEGFR соответственно. В двухцветных реконструкциях STORM мы также могли наблюдать IAV, которые колокализуются с EGFR или pEGFR. В частности, из-за повышенного разрешения мы могли различать полностью перекрывающиеся колокализации ( B , стрелки), а также IAV, которые связаны с более чем одним кластером (p) EGFR ( B , звездочка). Показаны обзорные изображения (слева), а также четыре увеличенные области (справа) для каждого обзора.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s011

(PDF)

S11 Рис. Активность EGFR-киназы необходима для IAV-опосредованной активации EGFR и инфекции.

Клетки A549 инфицировали IAV X31 (MOI = 100) при 4°C в течение 15 мин после предварительной обработки 10 мкМ гефитиниба в течение 1 ч мин при 37°C. Клетки фиксировали и иммуноокрашивали с использованием антител pEGFR (Y1068) для мечения активированного EGFR ( A ), а ядерную ДНК метили DAPI. Цитозольный сигнал pEGFR анализировали с использованием ImageJ ( B ).Чтобы проверить эффективность инфекции, клетки A549 инфицировали IAV X31 (MOI = 1) в течение 8 часов после предварительной обработки 10 мкМ гефитиниба в течение 1 часа при 37°C. Клетки фиксировали и иммуноокрашивали с использованием антител против NP ( A ), а ядерную ДНК метили DAPI ( C ). Инфицированных определяли количественно как ядерный сигнал NP/DAPI при анализе с помощью CellProfiler ( D ). Нанокластеры EGFR чувствительны к дестабилизации актинового или липидного домена (E). Клетки А549 инкубировали с латрункулином А (1 мкМ) или метил-β-циклодекстрином (МКД) (40 мкг/мл) в течение 1 ч при 37°С, затем фиксировали и окрашивали антителами против EGFR.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s012

(TIF)

S12 Рис. Коррекция мерцания молекул для данных EGFR.

Чтобы оценить количество излучающих молекул из набора данных STORM и избежать ложной кластеризации отдельных молекул, мы объединили несколько локализаций, происходящих из одной и той же молекулы, в одну локализацию. Процедура слияния требует расстояния промежутка, а также времени промежутка, в течение которого локализации будут считаться происходящими из одной и той же молекулы.Чтобы откалибровать эти значения, мы визуализировали изолированные меченые антитела против EGFR в экспериментальных условиях. Локализации, происходящие от одной молекулы, могут быть сгруппированы для определения их латерального распространения ( A ), а также темного времени между отдельными вспышками ( B ). Чтобы гарантировать высокую достоверность слияния, отсечку темнового времени определяли по квантилю 99% до 18 с. Используя экспериментально определенный разброс локализации ( A , 35 нм) и отсечку темнового времени, всплески локализации от одной и той же молекулы теперь можно объединить в одну позицию.В то время как каждая молекула подсчитывается несколько раз из-за мерцания молекулы (без поправок, C ), объединение позволяет более точно оценить количество молекул, избегая при этом ложной кластеризации (с поправкой, D ).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s013

(PDF)

S13 Рис. Экспериментальный положительный контроль для двухцветного анализа колокализации STORM.

Мы использовали две версии SNA с разными метками в качестве положительного контроля экспериментальной колокализации.Это также послужило нам в качестве номинатора для лучшей оценки степени колокализации нашей тестовой пары молекул SNA/EGFR. Клетки A549 были помечены двумя вариантами SNA, конъюгированными с Alexa 647, а также с Alexa 555 ( A ). Оба набора данных локализации были проанализированы с использованием CBC, в результате чего было получено значение колокализации C A , связанное с каждой отдельной локализацией. Гистограмма C A для одного канала показана в B . Мы установили порог 0,3, выше которого локализации считались колокализованными. C показывает один набор данных SNA, закодированный цветом в соответствии с C A . D показывает все локализации из одного и того же набора данных с C A > 0,3.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s014

(PNG)

S14 Рис. Размер кластера EGFR и число молекул не изменяются после стимуляции IAV или EGF.

Активация кластера EGFR может быть ингибирована ингибитором киназы EGFR Гефитинибом ( A, B ). Клетки A549 инфицировали IAV X31 (MOI = 100) при 4°C в течение 15 мин после предварительной обработки 10 мкМ гефитиниба в течение 1 ч мин при 37°C.Клетки фиксировали и иммуноокрашивали с использованием антител pEGFR (Y1068) для мечения активированного EGFR. Клетки визуализировали с помощью STORM, а кластер pEGFR идентифицировали с помощью DBSCAN. После стимуляции EGF или IAV мы обнаружили увеличение количества кластеров pEGFR на площадь (как также показано на рис. 5). Этот эффект может быть подавлен лечением гефитинибом ( A, B ). А549 обрабатывали инфекционной средой (контроль) или инфекционной средой, содержащей IAV (MOI = 100) или 100 нг/мл EGF в течение 15 мин при 4°C.Клетки фиксировали и иммуноокрашивали с использованием антител против EGFR. При любой стимуляции мы не смогли обнаружить изменения в размере кластеров EGFR или количестве молекул на кластер ( C ).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s015

(PDF)

S15 Рис. Коэффициенты диффузии отдельных молекул из sptPALM EGFR-mEos3 в клетках A549.

Клетки A549 временно трансфицировали EGFR-mEos3. Визуализация sptPALM и анализ траекторий одиночных молекул выявили широкий диапазон коэффициентов диффузии.Левые панели в A и B показывают распределение коэффициентов диффузии от sptPALM, полученных на дорсальной ( A ) и вентральной плазматической мембране ( B ). Молекулы были классифицированы как подвижные (D>0,5 мкм2/с) и неподвижные (D<0,5 мкм2/с) соответственно. Расчетные графики MDS ( A и B , правые панели) для обоих классов демонстрируют довольно линейную зависимость для подвижной фракции, в то время как кривая насыщается с увеличением времени задержки для неподвижной фракции, последнее указывает на пространственное ограничение.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s016

(PDF)

S16 Рис. Уровень экспрессии EGFR коррелирует не с размером кластера EGFR, а с количеством кластеров на область.

Клетки A549 трансфицировали плазмидами для EGFR-mEos3.2 за 24 часа до экспериментов по визуализации. В день эксперимента клетки фиксировали и визуализировали. Чтобы оценить уровень экспрессии, мы сделали снимок предварительно преобразованной зеленой версии mEos до фотоконверсии и получения PALM.Мы провели кластерный анализ DBSCAN для разных клеток с разными уровнями экспрессии ( A ). Мы заметили, что количество кластеров на площадь увеличивалось при более высоком уровне экспрессии, в то время как радиус кластера не менялся ( B ).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s017

(PDF)

S1 фильм. Эволюция вероятности удержания I

conf , а также расстояние частиц от источника для смоделированной траектории вируса.

Частица движется согласно D free , пока не встретит AF-кластер (верхняя панель, красные кружки). Из-за более высокой концентрации AF диффузия частиц замедляется до D conf , и частица удерживается. Удержание частиц определяется по увеличению вероятности удержания (средняя панель), а также по плато на расстоянии от исходного графика (нижняя панель).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008656.s018

(AVI)

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Катарину Хорст за поддержку и Андреаса Херрманна за полезные обсуждения рукописи.

Каталожные номера

  1. 1. Нейман Г., Нода Т., Каваока Ю. Возникновение и пандемический потенциал вируса свиного гриппа h2N1. Природа. Издательская группа «Природа»; 2009; 459: 931–939. пмид:19525932
  2. 2. Харрис А., Кардоне Дж., Винклер Д.К., Хейманн Дж.Б., Брехер М., Уайт Дж.М. и др. Плеоморфность вируса гриппа характеризуется криоэлектронной томографией. Proc Natl Acad Sci U S A. Национальная академия наук; 2006; 103: 19123–7. пмид:17146053
  3. 3.Mair CM, Ludwig K, Herrmann A, Sieben C. Связывание рецепторов и стабильность pH — как гемагглютинин вируса гриппа А влияет на вирусную инфекцию, специфичную для хозяина. Biochim Biophys Acta—Biomembr. 2014; 1838: 1153–1168. пмид:24161712
  4. 4. Sauter NK, Bednarski MD, Wurzburg BA, Hanson JE, Whitesides GM, Skeheel JJ, et al. Гемагглютинины из двух вариантов вируса гриппа связываются с производными сиаловой кислоты с миллимолярными константами диссоциации: исследование протонного ядерного магнитного резонанса на частоте 500 МГц.Биохимия. 1989; 28: 8388–96. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2605190 pmid:2605190
  5. 5. Лю С.Л., Чжан З.Л., Тянь З.К., Чжао Х.С., Лю Х., Сунь Э.З. и др. Эффективное и действенное исследование инфекции вируса гриппа с помощью отслеживания одиночных частиц на основе квантовых точек. АКС Нано. 2012;6: 141–150. пмид:22117089
  6. 6. Lakadamyali M, Rust MJ, Babcock HP, Zhuang X. Визуализация заражения отдельными вирусами гриппа. Proc Natl Acad Sci U S A.2003; 100: 9280–5. пмид:12883000
  7. 7. Rust MJ, Lakadamyali M, Zhang F, Zhuang X. Сборка эндоцитарного механизма вокруг отдельных вирусов гриппа во время проникновения вируса. Nat Struct Mol Biol. 2004; 11: 567–573. В наличии: pmid:15122347
  8. 8. де Врис Э., Черне Д.М., Винхольтс М.Дж., Кобос-Хименес В., Шольте Ф., Гарсия-Састре А. и др. Вскрытие эндоцитарных путей вируса гриппа А выявило макропиноцитоз как альтернативный путь проникновения. Пекош А, редактор.PLoS Патог. Публичная научная библиотека; 2011;7: e1001329. пмид:21483486
  9. 9. Eierhoff T, Hrincius ER, Rescher U, Ludwig S, Ehrhardt C. Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) способствует поглощению вирусов гриппа A (IAV) клетками-хозяевами. PLoS Патог. 2010;6: e1001099. пмид:20844577
  10. 10. Schlessinger J. Лиганд-индуцированная, рецептор-опосредованная димеризация и активация рецептора EGF. Клетка. 2002; 110: 669–672. пмид:12297041
  11. 11. Бётчер К., Людвиг К., Херрманн А., ван Хил М., Старк Х.Структура гемагглютинина гриппа при нейтральном и фузогенном рН по данным электронной криомикроскопии. ФЭБС лат. 1999; 463: 255–259. пмид:10606732
  12. 12. Шермелле Л., Хайнцманн Р., Леонхардт Х. Руководство по флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения. Джей Селл Биол. 2010; 190: 165–75. пмид:20643879
  13. 13. Лю З., Лэвис Л.Д., Бетциг Э. Визуализация динамики и структуры живых клеток на уровне одной молекулы. Мол Ячейка. Эльзевир Инк .; 2015; 58: 644–659. пмид:26000849
  14. 14.Хелл С.В., Вичманн Дж. Нарушение предела дифракционного разрешения с помощью стимулированного излучения: флуоресцентная микроскопия с истощением стимулированного излучения. Опция Летт. Оптическое общество Америки; 1994;19: 780. pmid:19844443
  15. 15. Раст М.Дж., Бейтс М., Чжуан Х. Визуализация субдифракционного предела с помощью стохастической оптической реконструктивной микроскопии (STORM). Нат Методы. 2006;3: 793–795. пмид:16896339
  16. 16. Betzig E, Patterson GH, Sougrat R, Lindwasser OW, Olenych S, Bonifacino JS, et al.Визуализация внутриклеточных флуоресцентных белков с нанометровым разрешением. Наука (80-). 2006; 313.
  17. 17. Хесс С.Т., Гирираджан ТПК, Мейсон МД. Визуализация сверхвысокого разрешения с помощью флуоресцентной микроскопии локализации фотоактивации. Biophys J. Биофизическое общество; 2006; 91: 4258–72. пмид:16980368
  18. 18. Берриман М., Франк З., Бретчер А. Эзрин концентрируется в апикальных микроворсинках самых разных эпителиальных клеток, тогда как моезин обнаруживается преимущественно в эндотелиальных клетках.Дж. Клеточные науки. 1993; 1043: 1025–1043. Доступно: http://jcs.biologist.org/content/105/4/1025.short
  19. 19. Хелениус А., Картенбек Дж., Саймонс К., Фрайс Э. О проникновении лесного вируса семлики в клетки BHK-21. Джей Селл Биол. 1980;84.
  20. 20. Sauvane C, Wayt J, Pelaseyed T, Bretscher A. Структура, регуляция и функциональное разнообразие микроворсинок в апикальном домене эпителиальных клеток. Annu Rev Cell Dev Biol. Ежегодные обзоры; 2015; 31: 593–621. пмид:26566117
  21. 21.Сакстон М.Дж., Якобсон К. ОТСЛЕЖИВАНИЕ ОДИНОЧНЫХ ЧАСТИЦ: приложения к динамике мембран. Annu Rev Biophys Biomol Struct. Ежегодные обзоры 4139 El Camino Way, P.O. Box 10139, Пало-Альто, Калифорния 94303–0139, США; 1997; 26: 373–399. пмид:9241424
  22. 22. Симсон Р., Шитс Э.Д., Якобсон К. Обнаружение временного бокового ограничения мембранных белков с использованием анализа отслеживания отдельных частиц. Биофиз Дж. 1995; 69: 989–993. пмид:8519998
  23. 23. Масия Э., Эрлих М., Массоль Р., Букро Э., Бруннер С., Кирххаузен Т.Dynasore, проницаемый для клеток ингибитор динамина. Ячейка Дев. 2006; 10: 839–50. пмид:16740485
  24. 24. Zhu L, Ly H, Liang Y. Передача сигналов PLC-γ1 играет специфическую для подтипа роль в постсвязывающем проникновении вируса гриппа А в клетку. Дж Вирол. 2014; 88: 417–24. пмид:24155396
  25. 25. Dempsey GT, Vaughan JC, Chen KH, Bates M, Zhuang X. Оценка флуорофоров для достижения оптимальной производительности при визуализации сверхвысокого разрешения на основе локализации. Природные методы. 2011. С. 1027–1036. пмид:22056676
  26. 26.Ян С., Раймонд-Стинц М.А., Ин В., Чжан Дж., Лидке Д.С., Стейнберг С.Л. и соавт. Картирование рецепторов ErbB на клеточных мембранах рака молочной железы во время передачи сигнала. Дж. Клеточные науки. 2007; 120: 2763–2773. пмид:17652160
  27. 27. Szabo Á, Szöllősi J, Nagy P. Совместная кластеризация ErbB1 и ErbB2, выявленная с помощью FRET-сенсибилизированного акцепторного отбеливания. Биофиз Дж. 2010; 99: 105–114. пмид:20655838
  28. 28. Малкуш С., Эндесфельдер У., Мондри Дж., Геллери М., Вервир П.Дж., Хейлеманн М.Анализ колокализации на основе координат данных микроскопии локализации одиночной молекулы. Гистохим клеточной биологии. 2012; 137: 1–10. пмид:22086768
  29. 29. Ариоотти Н., Лян Х., Сюй Ю., Чжан Ю., Йонекубо Ю., Индер К. и др. Активация рецептора эпидермального фактора роста ремоделирует липидную среду плазматической мембраны, вызывая образование нанокластеров. Мол Селл Биол. 2010; 30: 3795–804. пмид:20516214
  30. 30. Ван И, Гао Дж, Го С, Тонг Т, Ши С, Ли Л и др. Регуляция образования нанокластеров EGFR за счет ионного белок-липидного взаимодействия.Сотовый рез. Шанхайский институт биологических наук Китайской академии наук; 2014; пмид:25001389
  31. 31. Чжан М., Чанг Х., Чжан И., Ю Дж., Ву Л., Цзи В. и др. Рациональный дизайн настоящих мономерных и ярких фотоактивируемых флуоресцентных белков. Нат Методы. 2012;9: 727–729. пмид:22581370
  32. 32. Картер Р.Е., Соркин А. Эндоцитоз функциональной химеры рецептора эпидермального фактора роста и зеленого флуоресцентного белка. Дж. Биол. Хим. Американское общество биохимии и молекулярной биологии; 1998; 273: 35000–7.пмид:9857032
  33. 33. Manley S, Gillette JM, Patterson GH, Shroff H, Hess HF, Betzig E, et al. Картирование траекторий одиночных молекул с высокой плотностью с помощью фотоактивируемой локализационной микроскопии. Нат Методы. 2008;5: 155–157. пмид:18193054
  34. 34. Cisse II, Izeddin I, Causse SZ, Boudarene L, Senecal A, Muresan L, et al. Кластеризация полимеразы II. Наука (80-). 2013; 245: 664–667.
  35. 35. Папп И., Зибен С., Сиссон А.Л., Костка Дж., Бётчер С., Людвиг К. и др.Ингибирование активности вируса гриппа поливалентными гликоархитектурами с согласованными размерами. ХимБиоХим. WILEY-VCH Verlag; 2011; 12: 887–895. пмид:21384484
  36. 36. Папп И., Зибен С., Людвиг К., Роскамп М., Бётчер С., Шлехт С. и др. Ингибирование вирусной инфекции гриппа поливалентными функционализированными сиаловой кислотой наночастицами золота. Небольшой. WILEY-VCH Verlag; 2010;6: 2900–2906. пмид:21104827
  37. 37. Манзо К., Торрено-Пина Дж. А., Йостен Б., Рейнирен-Беерен И., Гуальда Э. Дж., Лоза-Альварес П. и др.Область шейки лектина С-типа DC-SIGN регулирует его поверхностную пространственно-временную организацию и способность связывать вирус с антигенпрезентирующими клетками. Дж. Биол. Хим. 2012; 287: 38946–38955. пмид:23019323
  38. 38. Якобсон К., Лю П., Лагерхольм Б.К. Латеральная организация и подвижность компонентов плазматической мембраны. Клетка. Эльзевир Инк .; 2019; 177: 806–819. пмид:31051105
  39. 39. Касалетто Дж.Б., Макклатчи А.И. Пространственная регуляция рецепторных тирозинкиназ в развитии и раке.Нат Рев Рак. Nature Publishing Group, подразделение Macmillan Publishers Limited. Все права защищены.; 2012; 12: 387–400. пмид:22622641
  40. 40. Абулроб А., Лу З., Бауманн Э., Воборник Д., Тейлор Р., Станимирович Д. и др. Наноразмерная визуализация кластеризации рецепторов эпидермального фактора роста: эффекты ингибиторов. Дж. Биол. Хим. 2010; 285: 3145–3156. пмид:19959837
  41. 41. Надь П., Дженеи А., Кирш К., Соллоси Дж., Дамьянович С., Джовин ТМ. Зависимая от активации кластеризация тирозинкиназы рецептора erbB2, обнаруженная с помощью сканирующей оптической микроскопии ближнего поля.Дж. Клеточные науки. 1999; 112 (Pt 1: 1733–41. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10318765
  42. 42. Сабо А., Хорват Г., Соллёси Дж., Надь П. Количественная характеристика крупномасштабной ассоциации ErbB1 и ErbB2 с помощью проточных цитометрических измерений Homo-FRET. Биофиз Дж. 2008; 95: 2086–2096. пмид:18487307
  43. 43. Надь П., Клаус Дж., Джовин Т.М., Арндт-Джовин Д.Дж. Распределение покоящихся и связанных с лигандом тирозинкиназ рецепторов ErbB1 и ErbB2 в живых клетках с использованием анализа числа и яркости.Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107: 16524–16529. пмид:20813958
  44. 44. Фей Д., Аксамитене Е., Кияткин А., Холоденко Б. Н. Моделирование передачи сигналов рецепторной тирозинкиназы: вычислительные и экспериментальные протоколы. Методы молекулярной биологии. Хумана Пресс Инк .; 2017. С. 417–453. пмид:28730495
  45. 45. Лави Ю., Гов Н., Эдидин М., Гебер Л.А. Время жизни кластеров мембран класса I главного комплекса гистосовместимости контролируется актиновым цитоскелетом. Биофиз Дж.биофизическое общество; 2012; 102: 1543–1550. пмид:22500754
  46. 46. Лави Й, Эдидин М а, Гебер Л а. Динамические участки мембранных белков. Биофиз Дж. Эльзевир; 2007; 93: Л35–7. пмид:17631538
  47. 47. Гарсия-Парахо М.Ф., Камби А., Торрено-Пина Дж. А., Томпсон Н., Якобсон К. Нанокластеризация как доминирующая черта организации плазматической мембраны. Дж. Клеточные науки. 2014; 127: 4995–5005. пмид:25453114
  48. 48. Шамель ВВА, Аречага И., Рисуэньо Р.М., ван Сантен Х.М., Кабесас П., Риско С. и др.Сосуществование поливалентных и моновалентных TCR объясняет высокую чувствительность и широкий диапазон ответа. J Эксперт Мед. 2005;202.
  49. 49. Лиллемейер Б.Ф., Мёртельмайер М.А., Форстнер М.Б., Хуппа Дж.Б., Гроувс Дж.Т., Дэвис М.М. TCR и Lat экспрессируются на отдельных белковых островках на мембранах Т-клеток и соединяются во время активации. Нат Иммунол. Исследования природы; 2010;11: 90–96. пмид:20010844
  50. 50. Уильямсон Д.Дж., Оуэн Д.М., Росси Дж., Магенау А., Верманн М., Гудинг Дж.Дж. и др.Ранее существовавшие кластеры адаптера Lat не участвуют в ранних событиях передачи сигналов Т-клетками. Нат Иммунол. Издательская группа «Природа»; 2011; 12: 655–662. пмид:21642986
  51. 51. Камби А., Юстен Б., Купман М., де Ланге Ф., Берен И., Торенсма Р. и др. Организация интегрина LFA-1 в нанокластеры регулирует его активность. Мол Биол Селл. Американское общество клеточной биологии; 2006; 17: 4270–81. пмид:16855029
  52. 52. Джакаман К., Кувата Х., Турет Н., Коллинз Р., Тримбл В.С., Данусер Г. и др.Цитоскелетный контроль диффузии CD36 способствует его рецепторной и сигнальной функции. Клетка. 2011; 146: 593–606. пмид:21854984
  53. 53. Ян Дж., Рет М. Олигомерная организация рецептора антигена В-клеток на покоящихся клетках. Природа. Исследования природы; 2010; 467: 465–469. пмид:20818374
  54. 54. Гаспаррини Ф., Фист С., Брукбауэр А., Маттила П.К., Мюллер Дж., Ничке Л. и др. Наноразмерная организация и динамика siglec CD 22 сотрудничают с цитоскелетом в сдерживании передачи сигналов BCR.EMBO J. 2015; 1–23.
  55. 55. Eisfeld AJ, Neumann G, Kawaoka Y. Выделение, культивирование и идентификация вируса гриппа А. Нат Проток. Издательская группа «Природа»; 2014;9: 2663–2681. пмид:25321410
  56. 56. Карпентер А.Э., Джонс Т.Р., Лампрехт М.Р., Кларк С., Канг И., Фриман О. и др. CellProfiler: программное обеспечение для анализа изображений для идентификации и количественной оценки клеточных фенотипов. Геном биол. Биомед Центральный; 2006;7: 100 рэндов. пмид:17076895
  57. 57. Сбальзарини И.Ф., Кумуцакос П.Отслеживание характерных точек и анализ траектории для видеоизображения в клеточной биологии. J Struct Biol. 2005; 151: 182–195. пмид:16043363
  58. 58. Тарантино Н., Тиневез Дж.-И., Кроуэлл Э.Ф., Буассон Б., Энрикес Р., Мхланга М. и др. TNF и IL-1 проявляют различные требования к убиквитину для индукции надмолекулярных структур NEMO-IKK. Джей Селл Биол. 2014;204.
  59. 59. Дуглас К.М., Зибен С., Арчетти А., Ламберт А., Мэнли С. Визуализация множества клеток со сверхвысоким разрешением с помощью оптимизированного плоского эпи-освещения.Нат Фотоникс. Исследования природы; 2016; 10: 705–708. пмид:27818707
  60. 60. Эдельштейн А., Амодай Н., Гувер К., Вейл Р., Стурман Н., Эдельштейн А. и др. Компьютерное управление микроскопами с помощью µManager. Текущие протоколы в молекулярной биологии. Хобокен, Нью-Джерси, США: John Wiley & Sons, Inc.; 2010. С. 14.20.1–14.20.17. https://doi.org/10.1002/0471142727.mb1420s92 pmid:208

  61. 61. Оливье Н., Келлер Д., Гончи П., Мэнли С. Удвоение разрешения при визуализации 3D-STORM за счет улучшенных буферов.ПЛОС Один. Публичная научная библиотека; 2013;8: e69004. пмид:23874848
  62. 62. Huang F, Hartwich TMP, Rivera-Molina FE, Lin Y, Duim WC, Long JJ, et al. Видеоскоростная наноскопия с использованием алгоритмов локализации одиночной молекулы, специфичных для камеры sCMOS. Нат Методы. Исследования природы; 2013; 10: 653–658. пмид:23708387
  63. 63. Овесны М., Кржижек П., Борковец Ю., Свиндрич З., Хаген Г.М. ThunderSTORM: комплексный подключаемый модуль ImageJ для анализа данных PALM и STORM и получения изображений сверхвысокого разрешения.Биоинформатика. 2014; 30: 2389–2390. пмид:24771516
  64. 64. Малкуш С., Хейлеманн М., Хенсель М., Клингауф Дж., Пилер Дж., Мюллер Б. и др. Извлечение количественной информации из данных изображений одиночных молекул со сверхвысоким разрешением с помощью анализатора микроскопии LAMA–LocAlization. Научный представитель Nature Publishing Group; 2016;6: 34486. pmid:27703238
  65. 65. Галиани С., Уэйт Д., Реглински К., Круз-Сарагоса Л.Д., Гарсия Э., Клаузен М.П. и др. Микроскопия со сверхвысоким разрешением выявляет компартментализацию белков пероксисомальной мембраны.Дж. Биол. Хим. Американское общество биохимии и молекулярной биологии; 2016; 291: 16948–62. пмид:27311714
  66. 66. Clausen MP, Galiani S, Serna JB de la, Fritzsche M, Chojnacki J, Gehmlich K, et al. Пути к оптической STED-микроскопии. НаноБиоВизуализация. Де Грюйтер Опен; 2014;1.
  67. 67. Эстер М., Эстер М., Кригель Х.-П., Сандер Дж., Сюй С. Алгоритм на основе плотности для обнаружения кластеров в больших пространственных базах данных с шумом. Proc 2nd Internat Conf Knowl Discov Data Min.1996 год; 226–231. Доступно: http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/summary?doi=10.1.1.121.9220

Инсулин и гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста, подобный фактору роста, синергически способствуют выживанию и пролиферации астроцитов в бессывороточной среде

https://doi.org/10.1016/j.jneumeth.2018.06.002Get rights and content •

Предлагается новая бессывороточная среда, содержащая инсулин и HB-EGF для культуры астроцитов.

Морфология клеток, культивируемых в этой среде, сходна с астроцитами головного мозга.

Эта среда более эффективна для культивирования астроцитов, чем среда, содержащая FBS.

Синергетическая активация AKT и ERK1/2 имеет решающее значение для культуры астроцитов.

Реферат

История вопроса

Системы in vitro, позволяющие поддерживать и экспериментировать с первичными культурами астроцитов, используются уже несколько десятилетий.Культуры астроцитов лучше всего сохраняются в среде, содержащей сыворотку, которая, как было обнаружено, изменяет морфологию и генные профили астроцитов.

Новый метод

Здесь мы сообщили о новой бессывороточной среде для культуры астроцитов, которая состояла из сред DMEM и NB с добавлением инсулина и гепарин-связывающего эпидермального фактора роста, подобного фактору роста (HB-EGF) (SF-IH). Средняя). Между тем, для сравнительного исследования использовали среду, содержащую FBS (FBS), состоящую из среды DMEM, содержащей 10% FBS.Кору головного мозга собирали у крыс Вистар на 1-й постнатальный период, клетки головного мозга выделяли и высевали в чашки для культивирования, покрытые поли-L-лизином, после 15-минутного прилипания с дифференциальной скоростью.

Результаты

По сравнению со средой FBS астроциты в среде SF-I-H были меньше и имели морфологию, несущую отростки. Анализы МТТ показали, что плотность клеток и скорость пролиферации были выше в среде SF-I-H, чем в среде FBS все время, а анализ проточной цитометрии показал, что среда SF-I-H способствует митозу клеток способом, сравнимым со средой FBS.Соответственно, вестерн-блот анализ также показал, что инсулин и HB-EGF синергетически активируют сигнальные каскады PI3K/AKT и MAPK/ERK1/2 в виде FBS.

Сравнение с существующими методами

Астроциты, культивированные в среде SF-I-H, росли быстрее, чем в среде FBS.

Заключение

В совокупности наши результаты показали, что среда SF-IH, в которой морфология клеток была сходна с морфологией астроцитов в головном мозге, была более эффективной для выживания и пролиферации астроцитов, чем среда FBS, предоставляя новую клеточную модель для изучения функций астроцитов без интерференция сыворотки.

Сокращения

HB-EGF

гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста, подобный фактору роста

GFAP

глиальный фибриллярный кислый белок

MTT

3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2- H-тетразолия бромид

DAPI

4′,6-диамидино-2-фенилиндол

FITC

флуоресцеинизотиоцианат

среда BSF

базальная бессывороточная среда

среда SF-I

бессывороточная среда с инсулином

среда SF-H4 сыворотка 900 среда без сыворотки с HB-EGF

среда SF-IH

среда без сыворотки с инсулином плюс HB-EGF

DVA

дифференциальная скорость адгезии

свободная среда

Астроциты

Выживаемость клеток

Пролиферация клеток

Рекомендуемые статьиСсылки на статьи (0)

© 2018 The Authors.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.